El uso de un ligando de afinidad según la fórmula (I)

en la que A1 y A2 se seleccionan del grupo que consiste en una amina,

éter y tioéter de las estructuras:

en las que R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo y alquil C1-C6-arilo;

B1 y B2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8 y arilo, donde dichos B1 y B2 pueden estar sustituidos con R2, OR2, SR2, o N(R2)2;

cada R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo y alquil C1-C6- arilo;

cada X representa independientemente un nitrógeno, un carbono que lleva un hidrógeno, un carbono que lleva un grupo cloro o un carbono que lleva un grupo ciano; y

Z es un grupo funcional capaz de reacción con una matriz seleccionado de amina, azida e hidroxilo o es una amina de agarosa activada por amina que reacciona directamente con el ligando;

para la producción de la proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) purificada

Procedimiento para la purificación de proteínas de unión a IL-18

Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la purificación de proteínas. Más específicamente, se refiere a la purificación de la proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) mediante cromatografía de afinidad. Específicamente, la invención comprende el uso de un ligando sintético en la cromatografía de afinidad.

Antecedentes de la invención

Las proteínas han llegado a ser comercialmente importantes como fármacos que generalmente se denominan también "biológicos". Uno de los más grandes retos es el desarrollo de procedimientos eficientes y rentables para la purificación de proteínas a escala comercial. Ahora hay disponibles muchos métodos para la preparación a gran escala de las proteínas. Sin embargo, los productos crudos, contienen también mezclas complejas de impurezas, que a veces son difíciles de separar del producto deseado.

Las autoridades sanitarias requieren altos estándares de pureza para las proteínas destinadas a la administración a seres humanos. En adición, muchos métodos de purificación pueden contener etapas que requieren la aplicación de bajo o alto pH, altas concentraciones de sal u otras condiciones extremas que pueden poner en peligro la actividad biológica de una proteína dada. Por lo tanto, es un reto establecer un procedimiento de purificación para cualquier proteína que proporcione la suficiente pureza a la vez que retenga la actividad biológica de la proteína.

La cromatografía es una técnica de purificación apropiada porque permite la separación de moléculas que tienen propiedades físico-químicas similares. De los diferentes tipos de cromatografía, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de fase inversa y la cromatografía de afinidad son las usadas más habitualmente en los procedimientos industriales.

Los sistemas cromatográficos de intercambio iónico han sido usados ampliamente para la separación de proteínas basándose principalmente en las diferencias de carga. En la cromatografía de intercambio iónico, los parches con carga sobre la superficie del soluto se atraen por cargas opuestas unidas a una matriz de cromatografía, siempre que la fuerza iónica del tampón que los rodea sea baja. La elución se lleva a cabo generalmente aumentando la fuerza iónica (esto es, la conductividad) del tampón para competir con el soluto por los sitios con carga de la matriz de intercambio iónico. Otra forma de llevar a cabo la elución del soluto es cambiar el pH y de este modo alterar la carga del soluto. El cambio en la conductividad o en el pH puede ser gradual (elución en gradiente) o en etapas (elución en etapas) .

Los intercambiadores aniónicos se pueden clasificar como débiles o fuertes. El grupo de carga sobre un intercambiador aniónico débil es una base débil, que se convierte en des-protonada y, por tanto, pierde su carga a pH alto. La DEAE-celulosa es un ejemplo de un intercambiador aniónico débil, en el que el grupo amino puede estar cargado positivamente por debajo de pH ~9 y pierde gradualmente su carga a valores más altos de pH. El dietilaminoetilo (DEAE) o dietil- (2-hidroxi-propil) aminoetilo (QAE) tienen cloruro como contraión, por ejemplo.

Un intercambiador aniónico fuerte, por otro lado, contiene una base fuerte, que permanece cargada positivamente a lo largo del intervalo de pH que se usa normalmente para la cromatografía de intercambio iónico (pH 1-14) . La Qsefarosa (Q significa amonio cuaternario) es un ejemplo de un intercambiador aniónico fuerte.

Los intercambiadores catiónicos se pueden clasificar también como débiles o fuertes. Un intercambiador catiónico fuerte contiene un ácido fuerte (tal como un grupo sulfopropilo) que permanece cargado a pH 1-14; mientras que un intercambiador catiónico débil contiene un ácido débil (tal como un grupo carboximetilo) , que pierde gradualmente su carga cuando el pH decrece por debajo de 4 o 5. El carboximetilo (CM) y el sulfopropilo (SP) tienen sodio como contraión, por ejemplo.

Los sistemas cromatográficos que tienen una fase estacionaria hidrófoba han sido también empleados ampliamente en la purificación de proteínas. Se incluyen en esta categoría la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y la cromatografía de líquidos de fase inversa (RPLC) . La base físicoquímica para la separación por HIC y por RPLC es el efecto hidrófobo, las proteínas se separan en una fase estacionaria hidrófoba basándose en diferencias de hidrofobicidad.

En la HIC, generalmente, se cargan sobre la columna de HIC las moléculas de la muestra en un tampón fuertemente salino. La sal del tampón interactúa con las moléculas de agua para reducir la solvatación de las moléculas en solución, exponiendo de este modo las regiones hidrófobas de las moléculas de la muestra, que son consecuentemente adsorbidas por la columna de HIC. Cuanto más hidrófoba es la molécula, menos sal se necesita para promover la unión. Habitualmente, se usa un gradiente decreciente en sal para eluir las muestras de la columna. Cuando la fuerza iónica disminuye, la exposición de las regiones hidrófilas de las moléculas aumenta y las moléculas se eluyen de la columna en orden creciente de hidrofobicidad. También se puede llevar a cabo la elución de la muestra por la adición de modificadores orgánicos o detergentes suaves para el tampón de elución. La HIC está resumida por ejemplo en Protein Purification, 2d Ed., Springer-Verlag, New York, pgs 176-179 (1988) .

En la HIC, hay disponibles diferentes soportes cromatográficos que llevan varios ligandos. Los ligandos se diferencian por su hidrofobicidad. Los ligandos hidrófobos usados comúnmente son restos fenilo, butilo u octilo.

La cromatografía de fase inversa es un método de purificación de proteínas muy relacionado con la HIC, ya que se basan ambas en las interacciones entre los grupos no polares accesibles al disolvente sobre la superficie de biomoléculas y los ligandos hidrófobos de la matriz. Sin embargo, los ligandos usados en la cromatografía de fase inversa están más altamente sustituidos con ligandos hidrófobos que los ligandos de la HIC. Aunque el grado de sustitución de los adsorbentes de HIC puede estar en el intervalo de 10-50 Imoles/mL de ligandos arilo C2-C8 de la matriz, normalmente se usan varios cientos de Imoles/mL de ligandos alquilo C4-C8 de la matriz para los adsorbentes de la cromatografía de fase inversa.

La cromatografía de interacción hidrófoba y la cromatografía de fase inversa se distinguen también porque la cromatografía de interacción hidrófoba se realiza en condiciones de disolvente acuoso y los cambios de fuerza iónica se utilizan para eluir la columna. La proteína se une típicamente en el estado nativo mediante grupos hidrófobos localizados en la superficie de la proteína, y el estado nativo se mantiene durante las condiciones de elución. Por contraste a esto, la cromatografía de fase inversa utiliza un disolvente hidrófobo (típicamente acetonitrilo) y la unión de un ligando es una función del reparto de fases entre la naturaleza hidrófoba del disolvente y el grupo funcional de la columna. Las proteínas se desnaturalizan típicamente hasta cierto grado en tales disolventes y se unen debido a la naturaleza hidrófoba de la secuencia de polipéptido completa. Puesto que la mayoría de los grupos hidrófobos están localizados en el núcleo de las proteínas globulares, la unión se relaciona con el grado de desnaturalización de la proteína y la accesibilidad de estos grupos a los grupos funcionales de la columna.

Entre las diferentes técnicas de purificación de proteínas, la cromatografía de afinidad merece particular atención. Dicha cromatografía cumple el requerimiento de selectividad extremadamente alta de la proteína objetivo a partir de mezclas complejas de impurezas, proporcionando de este modo un producto de mejor calidad.

La cromatografía de afinidad se basa en las funciones biológicas de una proteína para unirse a un ligando, esto es, un componente específico, tal como iones metálicos, péptidos, moléculas químicas, proteínas, ácidos nucleicos, que se une a la matriz de una columna. Este ligando puede estar inmovilizado o unido a una variedad de matrices, tales como celulosa o agarosa. La proteína objetivo se pasa entonces a través de la columna y se une a ella mediante el ligando, mientras que las otras proteínas se separan por elución. La purificación de una proteína objetivo... [Seguir leyendo]

1. El uso de un ligando de afinidad según la fórmula (I)

en la que A1 y A2 se seleccionan del grupo que consiste en una amina, éter y tioéter de las estructuras:

en las que R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo y alquil C1-C6-arilo; B1 y B2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8 y arilo, donde dichos B1 y B2 pueden estar sustituidos con R2, OR2, SR2, o N (R2) 2; cada R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo y alquil C1-C6

arilo; cada X representa independientemente un nitrógeno, un carbono que lleva un hidrógeno, un carbono que lleva un grupo cloro o un carbono que lleva un grupo ciano; y Z es un grupo funcional capaz de reacción con una matriz seleccionado de amina, azida e hidroxilo o es una amina de agarosa activada por amina que reacciona directamente con el ligando;

para la producción de la proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) purificada.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que A1 y A2 son una amina de la estructura B1 y B2 son independientemente alquilo C1-C6 o arilo; donde dichos B1 y B2 pueden estar sustituidos con R2, OR2, SR2, o N (R2) 2;

R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo y alquil C1-C6-arilo; y cada R2 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C6, arilo y alquil C1-C6arilo.

3. El uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que B1 y B2 pueden estar sustituidos con R2, OR2, SR2, o N (R2) 2 y dichos B1 y B2 o dichos B1 y B2 sustituidos se seleccionan independientemente del grupo de

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que B1 y B2 son hexilo.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que A1 y A2 son una amina de la estructura

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que cada X es nitrógeno.

7. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que Z es -NH-.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la matriz es agarosa.

9. El uso de un ligando de afinidad como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la captura de IL10 18BP a partir de un fluido.

10. Un procedimiento para la producción de IL-18BP purificada, que comprende someter un fluido a cromatografía de afinidad, utilizando un ligando de afinidad como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la cromatografía de afinidad se realiza a temperatura ambiente.

12. El procedimiento según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que la recuperación de IL-18BP es más de aproximadamente el 40 % o más de aproximadamente el 50 % después de la cromatografía de afinidad.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la pureza de la IL-18BP es aproximadamente > del 60 % o aproximadamente > del 70 % o aproximadamente > del 80 % después de la cromatografía de afinidad.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el porcentaje de IL-18BP monomérica es más alto del 80 % después de la cromatografía de afinidad.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, que comprende además una cromatografía seleccionada del grupo que consiste en cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de fase inversa y cromatografía de intercambio iónico.

16. El procedimiento según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, que comprende además una o más etapas de filtración para separación de virus.

17. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en el que la IL-18BP es una IL-18BP humana recombinante.

18. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en el que el fluido es el sobrenadante de cultivo celular exento de suero.

%% %%% Adsorbente Fracción Prot. total [μg/ml] Vol. [ml] Prot. total IL18BP IL18BP total [μg] pureza recuperación agregados dímeros monómeros [μg] [μg/ml]

Ligando nº 2 Carga 602 80 48160 216, 4 17312 36 100 6, 92 22, 39 70, 67 NB 124 118 14632 37, 7 4448, 6 30 26 0 6, 74 93, 26 E 727 10 7270 834, 6 8346 115 48 0, 25 13, 53 86, 22 ET 257 5 1285 272 1360 106 8 0, 66 17, 02 82, 32

Ligando nº 5 Carga 646 80 51680 229, 1 18328 35 100 7, 64 22, 37 69, 99 NB 91 100 9100 n. d. n. d. n. d. n. d. 0 3, 55 96, 45 E 1279 10 12790 1153, 1 11531 90 63 2, 6 17, 91 78, 49 ET 349 5 1745 376 1880 108 10 3, 26 21, 81 74, 93

Ligando nº 6 Carga 577 80 46160 227, 1 18168 39 100 5, 6 23, 3 71, 1 NB 48 116 5568 n. d. n.d. n.d. n. d. 0 3, 85 96, 15 E 887 10 8870 1026, 1 10261 116 56 0 10, 91 89, 09 ET 365 5 1825 428, 7 2143, 5 117 12 0 8, 96 91, 04

Ligando nº 7 Carga 701 80 56080 221, 3 17704 32 100 4, 4 23, 91 71, 65 NB 54 110 5940 9, 9 1089 18 8 0 4, 82 95, 18 E 867 10 8670 803 8030 93 45 0 10, 84 89, 16 ET 247 5 1235 346, 8 1734 140 10 0 12, 69 87, 31

Figura 2 Figura 3