PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCION DE UN FOTOSENSIBILIZANTE PARA SER EMPLEADO EN TERAPIA FOTODINAMICA Y FOTOSENSIBILIZANTE.

Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica y fotosensibilizante. La presente invención se refiere a un método para la preparación de un fotosensibilizante consistente en el tratamiento del alga Spirulina previamente secada para obtener la forma soluble en agua de clorina e 6, con elevado grado de pureza y un nuevo fotosensibilizante con valiosas propiedades terapéuticas. Este procedimiento permite el desarrollo de una nueva fórmula médica dotada de las más efectivas propiedades terapéuticas para el tratamiento de diferentes enfermedades oncológicas, empleando métodos de terapia fotodinámica basados en un contenido más elevado de clorina e 6. Permite, pues, la preparación de una forma de clorina e 6 soluble en agua de elevada pureza y estable mediante su conservación con N-Metil-D-glucamina, principio activo, que se emplea como fotosensibilizante en el tratamiento mediante terapia fotodinámica de cáncer y otras neoplasias de diferente origen. Igualmente, se mejora el método de preparación. El cáncer es un crecimiento tisular producido por la proliferación continua de células anormales con capacidad de invasión y destrucción de otros tejidos. Puede originarse a partir de cualquier tipo de célula en cualquier tejido corporal. No es una enfermedad única sino un conjunto de enfermedades que se clasifican en función del tejido y célula de origen. Existen varios cientos de formas distintas, siendo tres los principales subtipos: los sarcomas, que proceden del tejido conectivo, los carcinomas que proceden de tejidos epiteliales y un tercer tipo en el que se encuentran las leucemias y los linfomas. Es, en muchos casos, incurable y toda investigación cuyo objetivo sea frenarlo o curarlo definitivamente debe de ser potenciada sin ningún tipo de obstáculos. Se encuadra dentro de la industria de los productos fotosensibilizantes terapéuticos y, dentro de ésta, en productos terapéuticos para la medicina y farmacología. Así, se conocen varios métodos de obtención de sales de clorina e6 solubles en agua. Un método para la obtención de sales solubles de clorina e6 consiste en la hidrólisis del correspondiente trimetril éster en THF, tetrahidrofurano, bajo atmósfera de nitrógeno, en presencia de NaOH, hidróxido de sodio, durante cuarenta y ocho horas a temperatura ambiente. La estructura química del trimetil éster se refleja en la figura 1. El documento RU 2054476 describe un método de obtención de las sales trisódica y tripotásica de clorina e6. El método de obtención del ácido 18-carboxi-20-carboximetil-8-etenil-13-etil-2,3-dihidro-,7,12,17-tetrametil-21H,23Hporfirin-2-propionico o de sus sales, consiste en el tratamiento de la biomasa de Spirulina con una solución hidroalcohólica básica, obtención del extracto de múltiples derivados de clorinas, hidrólisis en medio básico a vacío, neutralización, obtención del precipitado que contiene alguna cantidad de clorina e6, a partir de la cual, al añadir NaOH o KOH, hidróxido de potásico, obtienen un producto soluble en agua. El documento RU 2144538 propone un método de obtención de clorinas solubles en agua en el cual las clorinas forman sales solubles en agua con un grupo amino primario o secundario lineal o cíclico o bien con un aminoácido básico. El documento RU 2183956 describe una mezcla de sales de K y Na, sales de potasio y sodio, de clorinas de contenido variable, que resulta del tratamiento consecutivo de la biomasa de Spirulina con acetona para la extracción de clorofila a, y a continuación, el tratamiento de dicho extracto en acetona con ácido clorhídrico para la transformación de clorofila a en feofitina a y su separación mediante centrifugación tras neutralización. A continuación, se procede a la hidrólisis del grupo éster en el sistema compuesto por ácido clorhídrico, acetona-hexano, después se purifica parcialmente mediante precipitación en la mezcla acetona-agua, se seca al aire, se realiza una hidrólisis básica primero en el sistema acetona-base en agua al 0,05-1%, y a continuación, se calienta hasta 40-60ºC con adición de una gran cantidad de base durante un intervalo de tiempo no determinado entre 20 y 90 minutos, se neutraliza el producto de reacción con ácido clorhídrico, se separa mediante centrifugación, se vuelve a suspender en acetona para realizar la separación de los productos de degradación y se seca en un alto intervalo de temperaturas de 40-100ºC durante una hora-30 días. En este documento se establece como objeto de invención un fotosensibilizante compuesto de, al menos, tres compuestos de la familia de las clorinas de contenido variable o inestable, en forma de sales de potasio y sodio solubles en agua. Frente a la presente invención estos sistemas conocidos arrojan los siguientes inconvenientes: - Ninguno de los métodos de obtención de sales de clorina solubles en agua permite obtener el producto final con alto grado de pureza y, en concordancia, obtener una fórmula médica estándar con propiedades biológicas determinadas y que sea estable durante su periodo de conservación, lo que dificulta la creación de formas terapéuticas basadas en clorina e6. - El método de la hidrólisis del correspondiente trimetril éster en THF, en atmósfera de nitrógeno, presenta el inconveniente de la síntesis previa del éster trimetílico de clorina e6 porque durante el proceso de saponificación en medio básico de los tres grupos éster, cabe la posibilidad de que se generen varios productos no saponificados por completo, tales como ésteres mono- y dimetilo, mientras que para llevar a cabo la hidrólisis definitiva de los grupos ésteres es necesario un largo periodo de tiempo de reacción, lo que influye negativamente sobre la estabilidad de la clorina e6 en medio básico. 2 ES 2 354 096 A1 - El documento RU 2054476 describe la obtención de sales trisódica y tripotásica pero en este método la cantidad de clorinas no se encuentra determinada, lo que dificulta la obtención de una fórmula médica para su utilización terapéutica. El principal inconveniente de éste método de obtención de sales de clorina e 6 solubles en agua es el hecho de que el producto final no puede tener un contenido estable y como consecuencia, tener características espectrales iguales, es decir, espectros de absorción y fluorescencia. - El documento RU 2144538 propone un método según el cual las clorinas que contienen tres restos carboxílicos forman sales solubles en agua con un grupo amino primario o secundario lineal o cíclico o bien con un aminoácido básico. Las desventajas de este método se encuentran en que para obtener las soluciones de clorinas en agua se utiliza un producto que contiene una mezcla de diferentes clorinas, donde el contenido en clorina e6 varía ampliamente encontrándose entre el 80-90%. El contenido relativamente bajo de clorina e6 se debe principalmente a la dificultad de su obtención a partir de la biomasa de Spirulina. - El documento RU 2183956 describe una transformación compleja no singular de las microalgas de Spirulina pero el resultado es un producto de contenido no determinado cuyas características físico-químicas y fotofísicas, así como sus cualidades biológicas van a depender de muchos factores y, por tanto, su uso como preparado médico puede tener consecuencias impredecibles. Las ventajas que aporta la presente invención sobre el estado de la técnica son las siguientes: - Se obtiene un fotosensibilizante soluble en agua que permanece estable durante su periodo de conservación y que tiene un contenido constante y elevado de la sustancia activa, clorina e6. - Se utiliza un método de obtención del fotosensibilizante empleando como reactivo de partida estándar metilfeoforbida a, de alta pureza, no inferior al 99%, según HPLC, técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla, así como sus características espectrales. - La utilización de metilfeoforbida a como material de partida facilita el seguimiento por HPLC del proceso de apertura del anillo exocíclico para originar la clorina e6. La presente invención está constituida a partir de dos etapas con sus correspondientes subetapas: A) Primera etapa.- Obtención del reactivo de partida metilfeoforbida a 1) Se procede al secado, mediante liofilización, de la microalga Spirulina Platensis, y a continuación, se suspenden veinte gramos de dicho alga en sesenta mililitros de metanol. 2) A continuación, se le añaden tres mililitros de ácido sulfúrico concentrado y se agita durante veinticuatro horas. 3) Se procede a la filtración y se reduce el volumen de metanol por medio de evaporación. 4) Al residuo aceitoso resultante se le añaden diez mililitros de hexano o bien éter etílico, se agita y se separa la capa de hexano, que se elimina. 5) Al citado residuo se le añaden diez mililitros de hexano repitiendo...

1. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, constituido por dos etapas con sus correspondientes subetapas, caracterizado por estar constituido a partir de dos etapas con sus correspondientes subetapas. La primera etapa consiste en la obtención del reactivo de partida metilfeoforbida a procediéndose al secado, mediante liofilización, de la microalga llamada Spirulina Platensis y posterior suspensión de veinte gramos de dicho alga en sesenta mililitros de metanol. 2. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1, caracterizado porque a continuación se le añaden tres mililitros de ácido sulfúrico concentrado y se agita durante veinticuatro horas. 3. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 y 2, caracterizado porque se procede a la filtración y se reduce el volumen de metanol por medio de evaporación. 4. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 3, caracterizado porque al residuo aceitoso resultante se le añaden diez mililitros de hexano o bien éter etílico, se agita y se separa la capa de hexano, que se elimina. 5. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 4, caracterizado porque al citado residuo se le añaden diez mililitros de hexano repitiendo la operación descrita en el apartado cuatro dos veces. 6. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 5, caracterizado porque a la capa inferior de dicho residuo se le añaden cincuenta mililitros de diclorometano y se diluye la mezcla con cien mililitros de agua fría. 7. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 6, caracterizado porque se procede a separar la capa orgánica, se lava con agua y se evapora el volumen al mínimo. 8. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 7, caracterizado porque a continuación se procede a purificar el residuo obtenido mediante cromatografía de columna en silica gel empleando como eluyente cloroformo/ éter etílico 95:5. 9. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 7, caracterizado porque se evaporan lo disolventes y la metilfeoforbida a obtenida se purifica mediante cristalización utilizando la mezcla cloroformo-metanol. La fórmula de metilfeoforbida se muestra en la figura 2. 10. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 9, caracterizado porque la segunda etapa se constituye ser la síntesis del fotosensibilizante a partir de metilfeoforbida a consistiendo en la adición, a una solución de 4 g de metilfeoforbida a en 750 mililitros de acetona a 35-40ºC, de diez gramos de KOH, hidróxido de potásico, en cien mililitros de agua, dejando en reposo durante cinco minutos, borboteando argón intensamente. 11. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 10, caracterizado porque a continuación y a una temperatura de 40-50ºC se le añaden 45 gramos de KOH en 450 mililitros de agua, manteniéndola a esa temperatura durante quince minutos. 12. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 11, caracterizado porque posteriormente se eleva la temperatura a 60ºC y se mantiene en esta temperatura durante 45 minutos, controlando el proceso de transformación de metilfeoforbida a en clorina e6, mediante cromatografía líquida de alta resolución. 13. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 12, caracterizado porque se procede enfriando la solución a 15-20ºC para neutralizarla con una solución de ácido clorhídrico, 126 mililitros de ácido clorhídrico al 35% más 250 mililitros de agua, hasta alcanzar un valor de pH de 4,5-5. 14. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 13, caracterizado porque en ese momento se separa el precipitado resultante mediante centrifugación, se aclara dos veces con agua estéril, suspendiéndolo en agua apirógena, se centrifuga dos o tres veces adicionales y se diluye el precipitado obtenido en una solución acuosa de 2,5 gramos de N-metil-D-glucamina en 500 mililitros de agua estéril apirógena. 6 ES 2 354 096 A1 15. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 14, caracterizado porque a continuación se eleva el pH hasta 7,75-8,20 añadiendo N-metil-Dglucamina como estabilizador y, después, se añade agua estéril apirógena hasta que la densidad óptica de la solución a 654 nanómetros y pH 9 sea de 400-420 unidades. 16. Procedimiento para la obtención de un fotosensibilizante para ser empleado en terapia fotodinámica, según reivindicación 1 a 15, caracterizado porque, por último, se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras de tamaño de poro que permite obtener soluciones estériles sin que se produzca el deterioro de la estructura del fotosensibilizante. 17. Fotosensibilizante, obtenido por el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque consiste en una solución de clorina e6 prácticamente pura, grado de pureza superior al 98,5%, estabilizada con N-metil-Dglucamina. La fórmula estructural del fotosensibilizante descrito, Fotontcine, se muestra en la Figura 3. 7 ES 2 354 096 A1 8 ES 2 354 096 A1 9 ES 2 354 096 A1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA