Un polipéptido de la subunidad hα1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.

Isoforma del canal de calcio del tipo n humano y usos de la misma

Campo de la invención

La invención pertenece a las isoformas de la subunidad a1B del canal de calcio tipo N humano.

Antecedentes de la invención

Los canales de calcio regulados por voltaje, también conocidos como canales de calcio dependientes del voltaje (VDCCs) son proteínas que abarcan la membrana de la multisubunidad que permiten la afluencia de calcio controlada de un ambiente extracelular al interior de una célula. Se han descrito varios tipos de canales de calcio regulados por voltaje en diferentes tejido, incluyendo los canales tipo N, tipo P/Q, tipo L y tipo T. Un canal de calcio regulado por voltaje permite la entrada en la célula del calcio en el momento de la despolarización de la membrana de la célula, que es una disminución de la diferencia en el potencial eléctrico entre el exterior y el interior de la célula.

Un canal de calcio regulado por voltaje contiene varias proteínas incluyendo subunidades de a1, a2, º y y. También son conocidos los subtipos de las subunidades del canal de calcio. Por ejemplo, los subtipos incluyen a1A, a1B, a1C, a1D, a1E, y a1S. Cada subunidad puede tener una o más isoformas que resultan de empalmes alternativos del ARN en la formación de un ARN mensajero completado que codifica la subunidad. Por ejemplo, se conocen al menos cuatro isoformas de la subunidad a1B del tipo N de rata (ver, por ejemplo, Lin y otros, Neuron 18: 153-166, 1997, que está relacionado con la expresión de variantes de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N en los ganglios simpáticos) .

Las isoformas de la subunidad a1A del canal de calcio se pueden expresar de forma diferente en diferentes tejidos (ver, por ejemplo, Lin y otros, 1997) . La expresión diferencial de las isoformas de las subunidades aumenta la posibilidad de desarrollar terapéuticos que son específicos para las distintas isoformas de las subunidades a1A, disminuyendo de este modo los efectos secundarios resultantes del uso de los terapéuticos que son efectivos para más de una isoforma del canal de calcio. Dos isoformas de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N, la a1B-1 y la a1B-2 fueron publicadas por Williams y otros en 1992 (Science 257: 389-395) , en un papel que está relacionado con la estructura y la expresión funcional de los canales de calcio del tipo N dependientes del voltaje sensibles a la w-conotoxina (w-Cg Tx) .

Dada la existencia de varias isoformas de rata adicionales en una familia de genes altamente conservada, es sorprendente que no se hayan descubierto isoformas humanas adicionales de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N. Dichas isoformas serían útiles para desarrollar terapéuticos específicos de la isoforma.

Resumen de la invención

La invención proporciona moléculas de acido nucleico aisladas, fragmentos únicos de esas moléculas, vectores de expresión que contienen lo anterior, y células huésped transfectadas con esas moléculas. La invención también proporciona polipéptidos aislados de los anteriores ácidos nucleicos. Lo anterior puede ser usado en el diagnostico o tratamiento de condiciones caracterizadas por actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano aumentada o reducida y se puede usar en métodos en los que es terapéuticamente útil aumentar o disminuir la actividad de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano como en tratamientos para la apoplejía, dolor (por ejemplo, dolor neuropático) lesión cerebral traumática y condiciones caracterizadas por la afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada o disminuida. Aquí, nosotros presentamos la identificación de una nueva subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano, la ha1B+SFVG, que juega un papel en la afluencia de calcio regulada por voltaje.

Se descubrió que una isoforma de la subunidad del canal de calcio a1B del cerebro (variante de empalme) contiene un inserto de cuatro aminoácidos en relación con las isoformas del canal de calcio a1B humano publicadas (SEQ ID NO:5 [número de entrada en el Banco de Genes M94172], SEQ ID NO:7 [número de entrada en el Banco de Genes M94173]) . Sorprendentemente, este inserto, SFVG (SEQ ID NO:2, codificado por la SEQ ID NO:1) , es similar pero no idéntico al inserto encontrado en un canal a1B de rata (número de entrada en el Banco de Genes M92905) . SE descubrió que una proporción significativa del ARNm de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano en el cerebro es el subtipo ha1B+SFVG; dada la abundancia de esta expresión el aislamiento de este subtipo no se espera tanto tiempo después la identificación de otras isoformas del a1B. La subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que contiene la SFVG también carece de una secuencia de aminoácido, ET, que está presente en las isoformas de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano publicadas (aminoácidos 1557-1558 de SEQ ID NO:5 y 7) .

La invención implica en un aspecto un polipéptido de la subunidad a1B del canal de calcio del tipo N humano aislado que incluye la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2 (un polipéptido ha1B+SFVG) . En una realización, el polipéptido comprende la secuencia de amino acido de SEQ ID NO:4, y preferiblemente consiste de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:4.

En otra realización el polipéptido del canal de calcio ha1B+SFVG consiste de la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica cualquiera de los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano anteriores. En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico incluye la SEQ ID NO:1. En una realización preferida, los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:3 (Williams y otros secuencia +SFVG, -ET) , y que consiste preferiblemente de la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO:3. En otra realización el ácido nucleico es un alelo de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:3.

En otro aspecto la invención es un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano enlazada operativamente a un promotor. También está incluida dentro de la invención una célula huésped transformada o transfectada con el vector de expresión.

La invención también proporciona composiciones que incluyen cualquiera de los polipéptidos anteriores, o ácidos nucleicos en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos son útiles para aumentar la cantidad de los polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula. Aumentar la cantidad de polipéptidos de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula resulta en una afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada. Esto es útil donde se desea aumentar la cantidad de la afluencia de calcio regulada por voltaje que es mediada por un canal de calcio del tipo N humano.

En consecuencia de acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para aumentar la expresión de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una célula. El método implica el paso de poner en contacto la célula con una molécula seleccionada del grupo consistente de un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano en una cantidad efectiva para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula. En ciertas realizaciones, la célula se pone en contacto con una o más subunidades ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, como una subunidad º, o ácidos nucleicos que codifican tales subunidades no ha1B+SFVG.

De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona una composición para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje del canal de calcio. La composición es para ser administrada a un sujeto con la necesidad de tal tratamiento de una molécula seleccionada del grupo consistente un ácido nucleico de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano y un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.

2. Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4.

3. Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:4.

4. Un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que consiste de la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la mencionada molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1,

o consiste de o comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:3.

6. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 5, conectado operativamente a un promotor.

7. Una célula huésped transformada, o transfectada, con un vector de expresión como se reivindica en la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 o una molécula de ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 5.

9. Un método in vitro para aumentar la cantidad de una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 en una célula, comprendiendo poner en contacto la célula con una molécula seleccionada del grupo consistente de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 y un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2, en una cantidad efectiva para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula.

10. Un método in vitro como es reivindica en la reivindicación 9, comprendiendo además poner en contacto la célula con una o más subunidades ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano del canal de calcio del tipo N humano o los ácidos nucleicos que codifican tales subunidades.

11. Una composición, para aumentar la afluencia de calcio regulada por voltaje del canal de calcio, que comprende un ácido nucleico que codifica una subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2, o un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2.

12. Un método para identificar compuestos principales para un agente farmacológico útil en el tratamiento de enfermedades asociadas con la afluencia de calcio regulada por voltaje aumentada o disminuida mediado por un canal de calcio del tipo N humano que comprende: proporcionar una célula u otro espacio encapsulado por membrana, que comprende un polipéptido de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2; poner en contacto la célula u otro espacio encapsulado por membrana con un agente farmacológico candidato bajo condiciones que, en ausencia del agente farmacológico candidato, causan una primera cantidad de afluencia de calcio regulada por voltaje en la célula u otro espacio encapsulado por membrana; determinar una cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje como una medida del efecto de los compuestos principales para un agente farmacológico en la afluencia de calcio regulada por voltaje por un canal de calcio del tipo N humano, en donde una cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje que es menor que la primera cantidad indica que el agente farmacológico candidato es un compuesto principal para un agente farmacológico que reduce la afluencia de calcio regulada por voltaje y en donde un cantidad de prueba de afluencia de calcio regulada por voltaje que es mayor que la primera cantidad indica que el agente farmacológico candidato es un compuesto principal para un agente farmacológico que aumenta la afluencia de calcio regulada por voltaje.

13. Un método como se reivindica en la reivindicación 12, comprendiendo además el paso de cargar la célula u otro espacio encapsulado por membrana con un compuesto sensible al calcio que es detectable en la presencia de calcio, en donde el compuesto sensible al calcio es detectable como una medida de la afluencia de calcio regulada por voltaje.

14. Un método para identificar compuestos que preferiblemente enlazan con una isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2, comprendiendo:

proporcionar un polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1; proporcionar un polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; poner en contacto el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o la m nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 y el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano con un compuesto; determinar el enlace del compuesto con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 y el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; en donde un compuesto que enlaza con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1 en una cantidad más grande que el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es un compuesto que preferiblemente enlaza con la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2.

15. Un método como se reivindica en la reivindicación 14, en donde los compuestos identificados enlazan selectivamente con una isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano, el método comprendiendo: proporcionar un polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO:1; proporcionar un polipéptido o un ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que codifica el polipéptido de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; poner en contacto el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o el ácido nucleico y el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano con un compuesto; determinar el enlace del compuesto con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o con el ácido nucleico y el polipéptido o ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano; en donde un compuesto que enlaza con el polipéptido de la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 o con el ácido nucleico pero no enlaza con el polipéptido o el ácido nucleico de la isoforma de la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano es un compuesto que enlaza selectivamente con la isoforma de la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2.

16. El método de la reivindicación 14 ó 15, en donde la subunidad ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano que comprende la SEQ ID NO:2 está expresada en la membrana celular de una primera célula u otro espacio encapsulado por membrana, y la subunidad no ha1B+SFVG del canal de calcio del tipo N humano está expresada en la membrana celular de una segunda célula u otro espacio encapsulado por membrana.