Un linfocito T aislado que expresa al menos un polinucléotido recombinante que codifica una citoquina que potencia la supervivencia de linfocitos T durante la fase de contracción de una respuesta inmunitaria,

en donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia codificante no nativa, con codones optimizados que codifica la citoquina, y en donde la citoquina es IL-15 y la secuencia codificante comprende SEQ ID NO: 4.

Inmunoterapia adoptiva con supervivencia de linfocitos T potenciada.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a la modificación de linfocitos T para terapia, investigación y otros usos. Las modificaciones de las células T potencian la supervivencia de linfocitos T.

La transferencia de linfocitos T adoptiva (inmunoterapia adoptiva) es la transferencia de linfocitos T a un sujeto para la terapia de una enfermedad. Tiene gran potencial para la terapia de una amplia variedad de enfermedades incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas. La inmunoterapia adoptiva se aprovecha de la respuesta inmunitaria, en la que el linfocito T desempeña un papel central.

Se piensa a menudo que la respuesta inmunitaria tiene distintas fases. Estas fases se han denominado fases de iniciación, expansión, contracción y mantenimiento o memoria (Schuluns & Lefrancois, Nature Rev. 3: 269-79 (2003)). Después de que un antígeno sea reconocido, la respuesta inmunitaria se "inicia". Esto va seguido de un rápido aumento en el número de células que participan en la respuesta inmunitaria durante la "fase de expansión". Sin expansión, la respuesta inmunitaria tiende a ser ineficaz. La siguiente fase, la "fase de contracción", controla el tamaño de la respuesta inmunitaria para prevenir una respuesta excesiva que podría dañar al huésped. La apoptosis, un tipo específico de muerte celular programada, es un importante proceso celular durante la fase de contracción de la respuesta inmunitaria. Si la contracción es excesiva, puede resultar una respuesta inmunitaria breve y/o débil. Finalmente, para una inmunidad sostenida, la respuesta inmunitaria debe entrar en la "fase de mantenimiento", y generar "linfocitos T de memoria".

Un obstáculo que limita la eficacia de la inmunoterapia adoptiva es la breve supervivencia de las células transferidas. Por ejemplo, la activación in vitro es una etapa frecuentemente empleada en la inmunoterapia adoptiva, pero linfocitos T activados in vitro tienden a experimentar apoptosis tras la transferencia in vivo. Se ha dado IL-2 a pacientes para estimular su respuesta inmunitaria en general, y para aumentar la inmunoterapia adoptiva. La IL-2 no potencia la supervivencia de linfocitos T durante la fase de contracción de la respuesta inmunitaria ni favorece la formación de linfocitos T de memoria, pero puede usarse para prolongar o continuar la fase de expansión. Sin embargo, la IL-2 tiene toxicidades significativas cuando se administra a pacientes y los pacientes no siempre pueden tolerar suficientes cantidades de IL-2 requeridas para una inmunoterapia adoptiva óptima. Las toxicidades asociadas con IL-2 a dosis alta incluyen escalofríos, náuseas, vómitos, diarrea y "síndrome de extravasación capilar" (que puede requerir cuidados intensivos). Además, los pacientes que se someten a terapia con IL-2 a dosis alta también reciben frecuentemente terapia profiláctica con antibióticos. Klebanoff et al. (PNAS vol. 7 (2004), págs. 1969-74) notifican la actividad antitumoral in vivo de células T CD8+ transfectadas con IL-15 y contemplan el uso de estas células en inmunoterapia adoptiva en seres humanos.

Lo anterior muestra que hay una necesidad de mejorar la inmunoterapia adoptiva.

La presente invención atenúa esta necesidad proporcionando linfocitos T con supervivencia potenciada durante la fase de contracción de la respuesta inmunitaria, y composiciones que comprenden los mismos. Ventajosamente, la invención atenúa las necesidades en la técnica mediante un método que puede evitar la toxicidad asociada con la terapia con IL-2 a dosis alta. Estas y otras ventajas de la invención, así como características aspectos inventivos adicionales, resultarán evidentes a partir de la descripción de la invención proporcionada en el presente documento.

Breve resumen de la invención

La invención proporciona linfocitos T que expresan un polinucléotido recombinante que codifica una citoquinacitoquina que potencia la supervivencia de linfocitos T durante la fase de contracción de la respuesta inmunitaria, y composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden los mismos. Además, lo dado a conocer es un método de preparación de linfocitos T con supervivencia potenciada, que comprende la transformación, por ejemplo, transducción, de linfocitos T con un polinucléotido recombinante que codifica una citoquina que potencia la supervivencia de linfocitos T durante las fases de contracción y mantenimiento de la respuesta inmunitaria. El método puede ponerse en práctica in vivo, o ex vivo y opcionalmente puede incluir además transferir las células transformadas, por ejemplo, transducidas, a un mamífero. Cuando los linfocitos T son transformados, por ejemplo, transducen, ex vivo y se transferidos a un mamífero receptor, el mamífero es preferiblemente el mismo mamífero del que se obtuvieron los linfocitos T (es decir, los linfocitos T son autólogos). Las composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, pueden usarse en el tratamiento de un estado médico, por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad autoinmunitaria e inmunodeficiencia. Las composiciones de la invención también pueden usarse in vitro para modificar cultivos celulares. Las composiciones de la invención también pueden almacenarse y usarse para proporcionar reactivos a los que pueden transferirse receptores de células T recombinantes (TCR) y otros restos, cada uno de los cuales tiene por sí mismo utilidad.

El polinucléotido recombinante transformado, por ejemplo, transducido, en los linfocitos T codifica preferiblemente una parte funcional, variante o fusión de IL-7, IL-15, o tanto IL-7 como IL-15, que por supuesto incluye IL-7 no modificada y/o IL-15.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

La figura 1 ilustra la actividad biológica de IL-15 expresada por células transformadas, según una realización de la invención. La figura 1A es un gráfico de la proliferación de células CTLL-2 (tal como se determina mediante la captación de ³H-timidina) en ausencia (barra izquierda) y en presencia (barra derecha) de IL-2. La figura 1B es un gráfico de la proliferación de células CTLL-2 en presencia de diferentes cantidades de IL-15 humana recombinante. La figura 1C es un gráfico de la proliferación de células CTLL-2 en presencia de sobrenadantes de células SupT1 que expresan el vector control MSGIN (♦), el vector MSGV-IL-15 (-) o el vector MSGV-Super IL-15 (-).

La figura 2 ilustra la supervivencia de linfocitos de sangre periférica (PBL) in vitro tras la retirada de citoquinas, según una realización de la invención. Específicamente, la figura 2 es un gráfico del recuento celular (en millones) frente a los días de retirada de citoquinas para células no transducidas (UT (♦)) y células transducidas con un vector control (MSGIN (-)), un vector que codifica IL-2-(-), IL-7-(-) o IL-15-(medbullet).

La figura 3 ilustra la producción de interferón gamma por PBL transformados cuando se cultivan conjuntamente con células de melanoma, según una realización de la invención. Específicamente, la figura 3 es un gráfico del IFN-γ producido en respuesta a la exposición a células de melanoma (526 (barra negra continua), 624 (barra blanca continua), 888 (barra con bandas) y 938 (barra gris continua)) por células no transducidas (NV), células L2D8 (control positivo) o células transducidas con vectores que codifican un TCR (TCR), IL-2, IL-7 o IL-15.

La figura 4 ilustra la producción de interferón gamma por PBL transformados cuando se estimulan con antígeno (gp100), según una realización de la invención. Específicamente, la figura 4 es un gráfico del IFN-γ producido por PBL no transducidos (NV), o PBL transducidos con un vector que codifica un TCR, IL-2, IL-7 o IL-15, tras la exposición a células presentadoras de antígeno pulsadas con diferentes concentraciones de péptido gp100 (de 0 a 100 ng/ml).

La figura 5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-15 madura que ilustra la optimización de codones (SEQ ID NO: 10), según una realización de la invención. La proteína madura contiene 114 aminoácidos. Se reemplazan sesenta y tres codones por secuencias alternativas que codifican el mismo aminoácido. Diecinueve de las sustituciones resultan en un desplazamiento de un codón pocas veces utilizado (<20%) a un codón utilizado más frecuentemente.

La figura 6 es un... [Seguir leyendo]

1. Un linfocito T aislado que expresa al menos un polinucléotido recombinante que codifica una citoquina que potencia la supervivencia de linfocitos T durante la fase de contracción de una respuesta inmunitaria, en donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia codificante no nativa, con codones optimizados que codifica la citoquina, y en donde la citoquina es IL-15 y la secuencia codificante comprende SEQ ID NO: 4.

2. El linfocito T aislado según la reivindicación 1, en donde el linfocito T sobrevive in vitro en ausencia de una citoquina exógena durante al menos 40 días.

3. El linfocito T aislado según la reivindicación 1, en donde el linfocito T sobrevive in vitro en ausencia de una citoquina exógena durante al menos 180 días.

4. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el linfocito T prolifera in vitro en ausencia de una citoquina exógena.

5. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el linfocito T resiste la apoptosis inducida por la retirada de IL-2 in vitro en ausencia de una citoquina exógena.

6. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde r el linfocito T reconoce antígeno in vitro en ausencia de una citoquina exógena.

7. El linfocito T aislado según la reivindicación 1, en donde el linfocito T expresa un primer polinucléotido recombinante y un segundo polinucléotido recombinante,

en donde el primer polinucléotido recombinante codifica IL-15, y

en donde el segundo polinucléotido recombinante codifica IL-7.

8. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia codificante no nativa tiene un 50% o menos de la energía libre pronosticada de la secuencia codificante nativa.

9. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el polinucleótido recombinante, el primer polinucléotido recombinante o el segundo polinucléotido recombinante comprende un gen suicida.

10. El linfocito T aislado según la reivindicación 9, en donde el gen suicida es el gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS).

11. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el linfocito T es un linfocito infiltrante de tumor (TIL).

12. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el linfocito T es un linfocito T humano.

13. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el linfocito T comprende un receptor específico para un antígeno de un estado médico.

14. El linfocito T aislado según la reivindicación 13, en donde el receptor es un receptor de células T endógeno (TCR).

15. El linfocito T aislado según la reivindicación 13, en donde el receptor es un receptor quimérico recombinante.

16. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el estado médico es cáncer.

17. El linfocito T aislado según la reivindicación 16, en donde el cáncer es melanoma.

18. Una población aislada de células que comprende el linfocito T según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Una composición farmacéutica que comprende el linfocito T según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o la población de células según la reivindicación 18, y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. Uso del linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o la población de células según la reivindicación 18 en la preparación de un medicamento para tratar un estado médico en un mamífero, en donde el estado médico se selecciona del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria y una inmunodeficiencia.

21. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 19 en la preparación de un medicamento para tratar un estado médico en un mamífero, en donde el estado médico se selecciona del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria y una inmunodeficiencia.

22. El uso según la reivindicación 20 ó 21, en el que el linfocito T es autólogo para el mamífero.

23. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde se administra IL-2 al mamífero tras la administración del medicamento.

24. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde se administra quimioterapia no mieloablativa al mamífero antes de la administración del medicamento.

25. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en donde el mamífero se inmuniza con un antígeno de la enfermedad antes de la administración del medicamento.

26. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en donde el linfocito T se expande in vitro antes de administrar del medicamento.

27. Una composición que comprende linfocitos T transformados con y que expresan al menos un polinucléotido recombinante que codifica una citoquina que potencia la supervivencia de linfocitos T durante la fase de contracción de la respuesta inmunitaria, en donde el polinucleótido recombinante comprende una secuencia codificante no nativa, con codones optimizados que codifica la citoquina, y en donde la citoquina es IL-15 y la secuencia codificante comprende SEQ ID NO: 4.

28. El linfocito T aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, la población de células según la reivindicación 18 o la composición farmacéutica según la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento de un estado médico en un mamífero, en donde el estado médico se selecciona del grupo que consiste en un cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria y una inmunodeficiencia.

29. El linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 28, en donde el linfocito T es autólogo para el mamífero.

30. El linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 28 ó 29, en donde se debe administrar IL-2 al mamífero tras la administración del linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica.

31. El linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde se administra quimioterapia no mieloablativa al mamífero antes de la administración del linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica.

32. El linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde el mamífero se inmuniza con un antígeno de la enfermedad antes de la administración del medicamento.

33. El linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en donde linfocito T debe expandirse in vitro antes de administrar el linfocito T aislado, la población de células o la composición farmacéutica.