INHIBICIÓN DE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE, AUMENTO DE LA PROLIFERACIÓN E INDUCCIÓN SELECTIVA DE LA APOPTOSIS POR FACTORES WNT.

Inhibición de la diferenciación de células madre, aumento de la proliferación e inducción selectiva de la apoptosis por factores Wnt La presente invención se refiere al sector de la medicina, más en particular al sector de la medicina de pulmón. La presente invención se refiere a la diferenciación de células madre, en particular a la regeneración y recuperación de tejido orgánico y al transplante. La presente invención se refiere más en particular a la inhibición de la diferenciación de células madre mediante la manipulación de una vía de Wnt. Más en particular, la presente invención se refiere al aumento de la proliferación y al control de la diferenciación de células de pulmón mediante la manipulación de una vía de Wnt. Órganos vitales, tales como el pulmón, el riñón, el hígado, el páncreas y la piel se caracterizan por la presencia de células epiteliales diferenciadas específicas para cada órgano basadas en células (mesenquimales) de una matriz de tejido conectivo específicas para cada órgano. La combinación de dichas células diferenciadas con la matriz de tejido conectivo está relacionada con la función específica de cada uno de dichos órganos. Dichas funciones específicas pueden ser tan variadas como, por ejemplo, el intercambio de gases en el pulmón, la filtración en el riñón, la desintoxicación y conjugación en el hígado, producción de insulina en las células de islotes pancreáticos o protección por la piel contra un medio peligroso. Una enfermedad o degeneración de dicho órgano es a menudo mortal, ya que una estructura del órgano degenerada o perdida es a menudo escasamente sustituida y porque las células especializadas de un órgano no pueden sustituir la función de otro órgano. Por todo el mundo se han buscado soluciones para el tratamiento de enfermedades degenerativas de órganos y la piel y sus apéndices. Para la piel, como estructura orgánica relativamente simple, se han realizado algunos avances mediante la aplicación de transplantes autólogos o heterólogos de piel. Se tratan trozos de piel (en forma de mallas) a efectos de que se estiren más allá del tamaño inicial y que cubran los defectos de la piel de un paciente con piel en forma de malla. Dichos transplantes ofrecen una base para que las células proliferen y cierren las lesiones de la piel. Para los órganos especializados en el cuerpo, las células regenerantes en el órgano in situ serían lo más óptimo ya que el transplante es a menudo más difícil y menos satisfactorio. El transplante conduce a menudo a efectos adversos del huésped frente al injerto o incluso del injerto frente al huésped. Sería también un gran logro si los órganos o una parte de los mismos, se pudieran mantener fuera del cuerpo (sinónimo de ex vivo) durante un periodo de tiempo, para darles la oportunidad de recuperarse mediante la regulación hacia arriba de la proliferación y la diferenciación de las células específicas de cada órgano. Aunque el órgano sea ex vivo, el paciente es, por ejemplo, dependiente de las máquinas para que asuman la función del órgano. En una etapa posterior, dicho órgano se coloca de nuevo en el paciente. Este método también es muy adecuado para células de la médula ósea que se extraen del paciente antes del tratamiento de la leucemia, y se sustituyen después del tratamiento. Dichas células de médula ósea se separan a menudo en diversas subpoblaciones y se analiza la ausencia de células leucémicas para evitar que las células leucémicas vuelvan a entrar al huésped. Muchas células no sobreviven a esta manipulación ex vivo; con el resultado de que un reimplante de la médula ósea es menos satisfactorio. En especial, dichas células altamente diferenciadas, tales como, por ejemplo, las células de riñón, las células productoras de insulina en los islotes de Langerhans del páncreas, y células glandulares y/o de folículos pilosos de la dermis, son muy difíciles de recuperar, en caso de que sea posible, y muy difíciles de mantener, una vez extraídas de su contexto en el cuerpo. Muchos investigadores intentan hallar modos de aumentar el tiempo de vida de dichas células especializadas en el cultivo y las posibilidades de que las células proliferen manteniendo su estado diferenciado. En la práctica, parece difícil conseguir este objetivo. En la presente invención, este objetivo se consigue mediante la mejora de la vía de señalización de Wnt en células madre/células progenitoras de dicho órgano que comprende células diferenciadas. En una realización, se da a conocer un tiempo de vida y proliferación y diferenciación mayores y una riqueza selectiva de células madre del pulmón. Una de las aplicaciones potenciales principales de las células madre es su utilización en los estudios de transplante en que estas células reconstituyen las células en el órgano enfermo. El transplante se realiza preferentemente con células madre que se pueden diferenciar in vivo en el tipo de célula deseado o con células madre diferenciadas previamente in vitro. Dicha diferenciación previa de células madre in vitro en un tipo de células deseado es un proceso que era difícil de controlar antes de la presente invención. Un aspecto de la presente memoria da a conocer un método para dirigir la diferenciación de células madre a un tipo de célula deseado in vitro para utilizar las células diferenciadas con el objetivo del transplante (véase, por ejemplo, el ejemplo 1). El control de dicha diferenciación se consigue limitando el aumento de la vía de señalización de Wnt hasta cierta ventana en estas células madre. El control de la vía de señalización de Wnt se consigue mediante la adición, como mínimo, de Wnt3a o una variante de Wnt3a que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la 2   secuencia de aminoácidos con Wnt3a. Sin seguir ninguna teoría, se cree que la fluctuación de la concentración de beta catenina intracelular se mantiene en un intervalo estrecho, induciendo así la diferenciación de un conjunto limitado de tipos de células. La familia de genes de Wnt codifica factores secretados importantes para el desarrollo, implicados en el crecimiento celular, diferenciación y organogénesis (Wodartz y Nusse, 1998). Los genes de Wnt codifican una familia de glicoproteínas secretadas que modulan el destino celular y el comportamiento en embriones a través de la activación de vías de señalización mediadas por receptor. Los sucesos de señalización de Wnt son iniciados por la activación del receptor que implica la unión al dominio rico en cisteínas (CRD) de la proteína receptora transmembrana 7 frizzled (Fz) (Bhanot y otros, 1996). Una señal clásica de Wnt suprime la actividad de la glicógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3), conduciendo a cambios en la fosforilación y una estabilidad incrementada de la proteína ß-catenina en el citoplasma (Hinck y otros, 1994). La ß-catenina es esencial para la activación de genes diana en respuesta a la señalización de Wnt (Miller y Moon, 1996; Willert y Nusse, 1998), ya que se compleja con los factores de transcripción de la caja HMG de la familia TCF/LEF (Behrens y otros, 1996; Molenaar y otros, 1996; Huber y otros, 1996). Las secuencias, patrones de expresión y actividades de Wnt se conservan de manera elevada en la evolución, de manera que ha sido posible comprender de manera profunda las funciones, y mecanismos de acción, de los genes Wnt a través de la síntesis de estrategias genéticas y biológicas celulares en diferentes organismos. Estos estudios sugieren que existen proteínas WNT funcionalmente distintas analizadas mediante la capacidad de transformar células y mediante las diferencias en respuestas embrionarias a las señales ectópicas de WNT. Además, los estudios de de ganancia de función y pérdida de función apoyan ambos la implicación de proteínas Wnt en la modulación del destino celular y el comportamiento celular durante el desarrollo de vertebrados, a menudo a través de interacciones combinatorias con otras vías de señalización para regular la expresión génica (Moon RT, Brown JD, Torres M. Trends Genet 1997 Apr; 13(4):157-62). Esto está apoyado por los datos sobre la capacidad y sensibilidad de células embrionarias de ratones de diferenciarse en tres capas germinales, las cuales eran inhibidas por mutaciones específicas en el gen de pólipo adenomatoso coli. (Kielman y otros, 2002) Se ha encontrado que los componentes de la vía de señalización de Wnt están presentes durante la organogénesis en el ratón (Roelink y Nusse, 1991; Buhler y otros, 1993; Parr y otros, 1993; Christiansen y otros, 1995; Wang y Shackleford, 1996; Cho y Dressler, 1998; Korinek y otros, 1998; Leimester y otros, 1998). Además, la pérdida de función de genes de Wnt y genes relacionados con Wnt conduce al desarrollo anormal en el ratón (McMahon y Bradley, 1990;... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para inhibir la diferenciación de una célula madre de pulmón, que comprende disponer dicha célula madre con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. 2. Método in vitro para inducir la proliferación de una célula madre de pulmón mediante la inhibición de la diferenciación de dicha célula madre, que comprende disponer dicha célula madre con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. 3. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha célula madre se dispone con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 1 ng y, como máximo, de 2000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la cantidad de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es, como mínimo, de 10 a, como máximo, 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cantidad de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es, como mínimo, de 20 a, como máximo, 1000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 6. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la cantidad de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, es, como mínimo, de 30 a, como máximo, 500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 7. Método in vitro para enriquecer una población de células madre de pulmón en una población de células mesenquimales que comprende dichas células madre de pulmón, mediante la inducción de la apoptosis en las células mesenquimales mediante la disposición de dichas células mesenquimales con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. 8. Método, según la reivindicación 7, en el que dicha célula madre mesenquimal se dispone con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 50 ng y, como máximo, de 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 9. Método, según la reivindicación 7 u 8, en el que dicha célula madre mesenquimal se dispone con Wnt3a o con una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, en una cantidad, como mínimo, de 100 ng y, como máximo, de 1000 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 10. Método in vitro para proporcionar un conjunto de células madre de pulmón a partir de una población de células mesenquimales y de células madre de pulmón, que comprende disponer dichas células mesenquimales con una cantidad inductora de la apoptosis de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, y disponer dichas células madre de pulmón con una cantidad inhibidora de la diferenciación de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a. 11. Método, según la reivindicación 10, en el que dicha Wnt3a o variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a se dispone en una cantidad, como mínimo, de 50 ng y, como máximo, de 1500 ng por ml de fluido de cultivo de tejido. 12. Método, según la reivindicación 10 u 11, en el que la diferenciación de un tipo de célula de pulmón distal es inhibida, como mínimo, parcialmente, mediante la administración de 10-250 ng de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a por ml de fluido de cultivo de tejido. 13. Método, según la reivindicación 12, en el que dicho tipo de célula de pulmón distal es una célula alveolar de tipo I o tipo II. 14. Método, según la reivindicación 10 u 11, en el que se incrementa selectivamente la proliferación y la diferenciación de un tipo de célula de las vías respiratorias superiores mediante la administración de 10-750 ng de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la 18   secuencia de aminoácidos con Wnt3a por ml de fluido de cultivo de tejido. 15. Método, según la reivindicación 14, en el que dicho tipo de célula de las vías respiratorias superiores es una célula epitelial traqueal y/o bronquial. 16. Utilización de Wnt3a o de una variante de Wnt3a biológicamente activa que tiene, como mínimo, el 90% de identidad en la secuencia de aminoácidos con Wnt3a, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia pulmonar, deficiencia del surfactante pulmonar, enfisema, distrés respiratorio crónico y/o cáncer de pulmón. 19     21   22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34     36   37