Implantes de neurotoxina biodegradables estabilizados.

Un implante de neurotoxina biodegradable, que comprende:

un componente de neurotoxina;

un componente polimérico biodegradable; y

un componente regulador de la acidez que incluye al menos uno de (i) los monómeros de los que se deriva unpolímero biodegradable y de (ii) los oligómeros que incluyen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a losmonómeros de los que se deriva un polímero biodegradable.

Implantes de neurotoxina biodegradables estabilizados

La presente invención se refiere a implantes biodegradables. Más particularmente, la invención se refiere a implantes biodegradables que incluyen una neurotoxina que es eficaz para proporcionar un efecto terapéutico a un paciente humano o animal.

La toxina botulínica tipo A es el agente biológico natural más letal conocido por el hombre. La toxina botulínica tipo A es una neurotoxina polipeptídica producida por la bacteria anaerobia, gram positiva Clostridium botulinum y produce una enfermedad neuroparalítica en los seres humanos y en los animales denominada botulismo. Aproximadamente 50 picogramos de una toxina botulínica tipo A comercialmente disponible (disponible de Allergan, Inc., Irvine, Calif. con la marca de fábrica BOTOX® (complejo de neurotoxina purificada) en viales de 100 unidades) es una LD50 en los ratones (esto es, 1 unidad) . Por lo tanto, una unidad de BOTOX contiene aproximadamente 50 picogramos (aproximadamente 56 atomoles) de complejo de toxina botulínica tipo A. Es interesante que, en una base molar, la toxina botulínica tipo A es aproximadamente 1, 8 miles de millones de veces más letal que la difteria, aproximadamente 600 millones de veces más letal que el cianuro de sodio, aproximadamente 30 millones de veces más letal que la toxina de cobra y aproximadamente 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado por B. R. Singh et al., Plenum Press, New York (1996) (donde el enunciado de que la LD50 de toxina botulínica tipo A de 0, 3 ng equivale a 1 U se corrige por el hecho de que aproximadamente 0, 05 ng de BOTOX equivale a 1 unidad) . Una unidad (U) de toxina botulínica se define como la LD50 en la inyección intraperitoneal en ratones Swiss Webster hembras con un peso de 18 a 20 gramos cada uno.

Los neurotransmisores se almacenan en vesículas sinápticas dentro del citoplasma de las neuronas y se transportan después a la membrana plasmática interna en la que las vesículas se acoplan y se fusionan con la membrana plasmática. Estudios de células nerviosas que emplean neurotoxinas clostridiales como sondas de la fusión de la membrana han revelado que la fusión de las vesículas sinápticas con la membrana celular en las células nerviosas depende de la presencia de proteínas específicas que están asociadas o con la vesícula o con la membrana diana. Estas proteínas han sido denominadas SNAREs. Una proteína denominada alternativamente sinaptobrevina o VAMP (proteína de la membrana asociada a la vesícula) es una SNARE asociada a la vesícula (v-SNARE) . Hay al menos dos isoformas de sinaptobrevina; estas dos isoformas están diferencialmente expresadas en el sistema nervioso central del mamífero y se asocian selectivamente con las vesículas sinápticas en las neuronas y con las organelas secretoras en las células neuroendocrinas. Las SNAREs asociadas con la membrana diana (t-SNARES) incluyen sintaxina y SNAP-25. Después del acoplamiento, la proteína VAMP forma un complejo central con sintaxina y SNAP-25; la formación del complejo central parece que es una etapa esencial para la fusión con la membrana. Véase Neimann et al., Trends in Cell Biol. 4:179-185:1994.

Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas en general inmunológicamente distintas, que son respectivamente los serotipos de neurotoxina botulínica A, B, C1, D, E, F y G cada uno de los cuales se distingue por la neutralización con anticuerpos específicos del tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en las especies animales a las que afectan y en la duración de la parálisis que provocan. Por ejemplo, se ha determinado que la toxina botulínica tipo A es 500 veces más potente, medida cono la proporción de parálisis producida en la rata, que lo es la toxina botulínica tipo B. Adicionalmente, se ha determinado que la toxina botulínica tipo B no es tóxica en los primates a una dosis de 480 U/kg que es aproximadamente 12 veces la LD50 de la toxina botulínica tipo A en el primate. La toxina botulínica aparentemente se une con alta afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, se desplaza a la neurona y bloquea la liberación de acetilcolina.

Cualquiera que sea el serotipo, el mecanismo molecular de intoxicación de la toxina parece que es similar e implica al menos tres etapas o estadíos. En la primera etapa del proceso, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona diana a través de una interacción específica entre la cadena pesada, cadena H, y un receptor de la superficie de la célula; y se cree que el receptor es diferente para cada tipo de toxina botulínica y para la toxina tetánica. El segmento terminal carboxilo de la cadena H, HC, parece que es importante para el acceso de la toxina a la superficie celular.

En la segunda etapa, la toxina cruza la membrana plasmática de la célula envenenada. En primer lugar la toxina es absorbida por la célula por medio de la endocitosis mediada por el receptor, y se forma un endosoma que contiene la toxina. Después la toxina escapa del endosoma hacia el citoplasma de la célula. Se cree que esta etapa está mediada por el segmento terminal amino de la cadena H, HN, que desencadena un cambio de conformación de la toxina en respuesta a un pH de aproximadamente 5, 5 o inferior. Es conocido que los endosomas tienen una bomba de protones que reduce el pH intra-endosómico. El desplazamiento conformacional expone los residuos hidrófobos de la toxina, lo que permite a la toxina incrustarse en la membrana endosómica. La toxina (o como mínimo la cadena ligera) se desplaza entonces a través de la membrana endosómica hacia el citoplasma.

La última etapa del mecanismo de la actividad de la toxina botulínica parece que implica la reducción del enlace disulfuro que une la cadena pesada, cadena H, y la cadena ligera, cadena L. Toda la actividad tóxica de las toxinas botulínica y tetánica está contenida en la cadena L de la holotoxina; la cadena L es una endopeptidasa de zinc (Zn++) que escinde selectivamente las proteínas esenciales para el reconocimiento y acoplamiento de las vesículas que contienen los neurotransmisores con la superficie citoplásmica de la membrana plasmática, y la fusión de las vesículas con la membrana plasmática. La neurotoxina tetánica y las toxinas botulínicas B, D, F y G causan la degradación de la sinaptobrevina (llamada también proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP) ) , una proteína de membrana sinaptosómica. La mayor parte de las VAMP presentes en la superficie citoplásmica de la vesícula sináptica se separan como resultado de cualquiera de estos sucesos de escisión. Los serotipos A y E escinden la SNAP-25. El serotipo C, se creyó en un principio que escindía la sintaxina, pero se ha encontrado que escinde la sintaxina y la SNAP-25. Cada toxina escinde específicamente un enlace diferente (excepto la tetánica y la tipo B que escinden el mismo enlace) .

Las toxinas botulínicas han sido usadas en clínica para el tratamiento de trastornos neuromusculares caracterizados por la hiperactividad de los músculos esqueléticos. La toxina botulínica tipo A fue aprobada por la U.S. Food and Drug Administration en 1989 para el tratamiento del blefaroespasmo, estrabismo y espasmo hemifacial. Los serotipos de toxina botulínica no tipo A tienen aparentemente una potencia menor y/o una duración más corta de la actividad en comparación con la toxina botulínica tipo A. Los efectos clínicos de la toxina botulínica tipo A intramuscular periférica se ven normalmente antes de una semana después de la inyección. La duración típica del alivio sintomático de una única inyección intramuscular de toxina botulínica tipo A es de una media de aproximadamente tres meses.

Aunque todos los serotipos de toxina botulínica inhiben aparentemente la liberación del neurotransmisor acetilcolina en la unión neuromuscular, lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o escindiendo estas proteínas en diferentes sitios. Por ejemplo, los tipos botulínicos A y E escinden ambos la proteína sinaptosómica asociada de 25 kiloDalton (kD) (SNAP-25) , pero acceden a diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína. Las toxinas botulínicas tipos B, D, F y G actúan sobre una proteína asociada a la vesícula (VAMP, llamada también sinaptobrevina) , escindiendo cada serotipo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, se ha demostrado que la toxina botulínica tipo C1 escinde tanto la sintaxina como la SNAP-25. Estas diferencias en el mecanismo de acción pueden afectar a... [Seguir leyendo]

1. Un implante de neurotoxina biodegradable, que comprende:

un componente de neurotoxina; un componente polimérico biodegradable; y un componente regulador de la acidez que incluye al menos uno de (i) los monómeros de los que se deriva un polímero biodegradable y de (ii) los oligómeros que incluyen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a los monómeros de los que se deriva un polímero biodegradable.

2. El implante de la reivindicación 1, en el que los monómeros y los oligómeros se proporcionan en un intervalo de 0, 1 % (p/p) a 30 % (p/p) del implante.

3. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente regulador de la acidez comprende una combinación de monómeros de los que se deriva un polímero biodegradable y de oligómeros que incluyen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a las unidades monoméricas incluidas en el polímero biodegradable.

4. El implante de la reivindicación 2, en el que el polímero biodegradable se selecciona del grupo que consiste en poliésteres, poli (orto ésteres) , y polianhídridos, y mezclas de los mismos.

5. El implante de la reivindicación 2, en el que el polímero biodegradable se selecciona del grupo que consiste en ácido poli-láctico (PLA) , ácido poli (lactida-co-glicolida) (PLGA) , ácido poli-L-láctico (PLLA) , policaprolactona, poli (orto acetato) , y mezclas de los mismos.

6. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente polimérico biodegradable incluye un primer polímero biodegradable, y el componente regulador de la acidez incluye al menos uno de (i) los monómeros de los que se deriva un primer polímero biodegradable, y de (ii) los oligómeros que incluyen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a las unidades monoméricas incluidas en el primer polímero biodegradable.

7. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente polimérico biodegradable incluye un primer polímero biodegradable, y el componente regulador de la acidez incluye al menos uno de (i) los monómeros de los que se deriva un segundo polímero biodegradable, y de (ii) los oligómeros que incluyen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a las unidades monoméricas incluidas en el segundo polímero biodegradable.

8. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente polimérico biodegradable incluye un primer polímero biodegradable, y el componente regulador de la acidez incluye al menos uno de (i) los monómeros de los que se deriva un segundo polímero biodegradable, y de (ii) los oligómeros que incluyen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a las unidades monoméricas incluidas en un tercer polímero biodegradable.

9. El implante de la reivindicación 1, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.

10. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente regulador de la acidez comprende monómeros de los cuales se deriva un polímero biodegradable, y el implante comprende además sales de los monómeros.

11. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente de neurotoxina comprende una neurotoxina clostridial.

12. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente de neurotoxina comprende una toxina botulínica.

13. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente de neurotoxina comprende una toxina botulínica seleccionada del grupo que consiste en toxinas botulínicas tipos A, B, C1, D, E, F, y G, y mezclas de las mismas.

14. El implante de la reivindicación 1, en el que el implante comprende una cantidad de una toxina botulínica entre 1 unidad y 500.000 unidades.

15. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente de neurotoxina comprende una toxina botulínica tipo

A.

16. El implante de la reivindicación 15, en el que la cantidad de toxina botulínica tipo A está entre 10 unidades y 2000 unidades.

17. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente polimérico biodegradable incluye un primer polímero biodegradable que tiene unidades monoméricas, y los oligómeros del componente regulador de la acidez tienen unidades monoméricas sustancialmente idénticas a las unidades monoméricas del primer polímero biodegradable

18. El implante de la reivindicación 1, en el que el componente regulador de la acidez incluye al menos uno de (i) un primer monómero y de (ii) un oligómero derivado de un segundo monómero diferente del primer monómero, y el polímero biodegradable se deriva de un tercer monómero diferente de ambos, el primero y el segundo monómeros.

19. El implante de la reivindicación 15, en el que el componente polimérico biodegradable incluye una pluralidad de 5 diferentes polímeros biodegradables.

20. El implante de la reivindicación 15, en el que el componente regulador de la acidez incluye monómeros de los que se deriva un polímero biodegradable del componente polimérico biodegradable.

21. Un método para preparar el implante de la reivindicación 15, que comprende una etapa de amasado del

componente de neurotoxina, el componente polimérico biodegradable, y el componente regulador de la acidez 10 juntos.