FORMULACIÓN SECA PARA LA INMUNIZACIÓN TRANSCUTÁNEA.

Esta invención se refiere a una formulación seca útil para la inmunización transcutánea para inducir una respuesta inmune específica de antígeno. En particular, las formas físicas de la formulación seca incluyen artículos de fabricación como parches y otros sustratos sólidos (por ejemplo, un apósito) usados para aplicar la formulación seca en la piel del sujeto que la necesita. Esta formulación se estabiliza para almacenamiento y transporte y, sorprendentemente, la respuesta inmune inducida es más robusta que con formulaciones líquidas previas. 2. Descripción de la Técnica Relacionada La piel, el mayor órgano humano, es una parte importante de la defensa del cuerpo frente a la invasión de agentes infecciosos y el contacto con sustancias nocivas (véase Bos, 1997). La piel, sin embargo, también puede ser una diana de infecciones crónicas en las que los organismos establecen su presencia eludiendo el sistema inmune. La piel está compuesta por tres capas; la epidermis, la dermis y la grasa subcutánea. La epidermis está compuesta por las capas basal, espinosa, granulosa y cornificada; el estrato córneo comprende la capa cornificada y lípidos (Moschella y Hurley, 1992). Se ha indicado que las principales células presentadoras de antígeno de la piel, las células de Langerhans, están en las capas espinosas medias a superiores de la epidermis en los seres humanos. La dermis contiene principalmente tejido conectivo. Los vasos sanguíneos y linfáticos están confinados a la dermis y a la grasa subcutánea. El estrato córneo, una capa de células muertas de la piel y lípidos, se ha visto tradicionalmente como una barrera frente al mundo hostil, excluyendo a los organismos y a las sustancia nocivas de las células viables que están por debajo del estrato córneo (Bos, 1997). La protección secundaria proporcionada por las células presentadoras de antígeno de la piel tales como las células de Langerhans se ha reconocido muy recientemente (Celluzzi y Falo, 1997). Además, la capacidad de inmunizar a través de la piel usando el concepto crucial de un adyuvante activo en la piel se ha descrito muy recientemente (Glenn et al., 1998). El reconocimiento científico de este importante avance en la vacunación fue rápido. "Es un resultado muy sorprendente y es magnífico", dijo el experto en vacunas Barry Bloom del Howard Hughes Medical Institute y el Albert Einstein College of Medicine en Nueva York, la estrategia parece "muy fácil, muy segura y ciertamente económica" (Noticias de la CNN, 26 de Febrero, 1998). Otro resultado sorprendente fue la capacidad de usar una toxina como un adyuvante activo en la piel eficaz para la inmunización transcutánea sin efectos adversos para el huésped inmunizado. Por ejemplo, Vibrio cholerae secreta la toxina del cólera (CT) y E. coli enterotoxigénica (ETEC) secreta la enterotoxina sensible al calor (LT). Estas proteínas causan la secreción de fluido intestinal y diarrea masiva (Spangler, 1992) y son consideradas toxinas peligrosas. Vibrio cholerae y la toxina del cólera (CT) son ejemplos de agentes infecciosos y de productos bacterianos nocivos, respectivamente, frente a los que podría haberse esperado una protección de la piel. Craig (1965) indicó que filtrados de heces de pacientes con cólera inyectados subcutáneamente en conejos o cobayas producían una aparición retardada característica, induración (hinchazón) edematosa sostenida, que se indujo por la presencia de la toxina en la piel. La hinchazón y la extravasación vascular fueron tan dramáticas que se atribuyeron a un factor de permeabilidad desconocido que posteriormente se mostró que era CT en sí misma. Así, se podría haber esperado razonablemente que CT fuera extremadamente reactogénica cuando se pusiera en la piel o se insertara a través del estrato córneo y causaría un enrojecimiento e hinchazón similares. El ensayo de Craig se convirtió en una medición estándar para la presencia y cantidad de CT en filtrados de heces o medio de cultivo. Datta confirmó que esta reactividad de la piel se debía a la toxina del cólera (véase Finkelstein y LoSpallutto, 1969). Craig (1965) advirtió, "La ausencia de lesiones en la piel en el cólera clínico no descarta ciertamente la posibilidad de que el agente nocivo responsable del daño intestinal también pueda tener un efecto perjudicial en la piel siempre que se aplique en la piel en concentración suficiente". La extrema reactogenicidad de la toxina del cólera en la piel se usó como un ensayo para su toxicidad y dicha técnica anterior evidenció una expectación de que la toxina del cólera sería reactogénica si se aplicaba en la piel, produciendo una reacción indeseable. En contraste, hemos mostrado que la toxina del cólera es inmunogénica, actuando tanto como antígeno como adyuvante, cuando se pone en la piel. Puede inmunizar sin ningún efecto secundario local o sistémico resultante. Esta ausencia de reactogenicidad cuando la toxina del cólera se pone en la piel para la inmunización transcutánea fue sorprendente y contradijo conclusiones que podrían haberse deducido de la técnica anterior. Una formulación líquida de CT puesta en la piel actuó como un adyuvante no tóxico, no reactogénico, en contraste con las expectativas de Craig, mientras que la inyección de CT en la piel resulta en hinchazón y enrojecimiento. Así, no era 2   obvio antes de nuestra invención que la toxina del cólera u otras exotoxinas que ADP-ribosilan serían útiles para la inmunización transcutánea Véanse WO 98/20734 y Pat. U.S. Nos. 5.910.306 y 5.980.898. Esta expectativa de que la toxina del cólera u otros adyuvantes fueran altamente reactogénicos cuando se ponen en la piel fue apoyada adicionalmente por descubrimientos usando el adyuvante prototípico, adyuvante de Freund. Kleinau et al. (1994) encontraron que la administración tópica de adyuvante incompleto de Freund en la piel de ratas inducía artritis como se evidenciaba clínicamente y por la proliferación del recubrimiento de la articulación, infiltrados inflamatorios y destrucción del hueso y del cartílago. Además declararon, "Esta investigación se ha centrado en el papel artritogénico del aceite mineral, un prototipo para un adyuvante inmunológico. Es verosímil, sin embargo, que varios compuestos adicionales con propiedades adyuvantes también puedan tener el mismo efecto cuando se aplican percutáneamente (sic)". En contraste con esta sugerencia, hemos usado una emulsión agua-en-aceite de un adyuvante activo en la piel (LT) y hemos encontrado que induce de manera segura una respuesta inmune sin ningún efecto sistémico. Véanse WO 98/20734 y Pat. U.S. Nos. 5.910.306 y 5.980.898. Así, hubiera sido de esperar que la aplicación transcutánea de adyuvante, y especialmente un adyuvante en una emulsión, hubiera producido artritis en este modelo animal. Nuestros descubrimientos, sin embargo, mostraron de manera inesperada que dichas formulaciones carecían de reactogenicidad. La inmunización transcutánea requiere tanto el paso del antígeno a través de las barreras exteriores de la piel, que se pensaba que eran impermeables a dicho paso, como una respuesta inmune frente al antígeno. Contact Dermatitis de Fisher declara que las moléculas de más de 500 daltons no pueden pasar normalmente a través de la piel. Además, según Hurley, "La piel debe su durabilidad a la dermis, pero su impermeabilidad química reside en la epidermis y casi exclusivamente en su capa muerta exterior, el estrato córneo". Se conocen reacciones de la piel tales como dermatitis alérgica o atópica, pero la inducción de una respuesta inmune sistémica que provoca efectores inmunes específicos de antígeno y proporciona una ventaja terapéutica por la simple aplicación del inmunógeno en la piel no parece haberse enseñado o sugerido antes de nuestra invención. Generalmente, las células presentadoras de antígeno (APC) de la piel, y particularmente las células de Langerhans, son dianas de agentes de sensibilización que resultan en patologías que incluyen dermatitis de contacto, dermatitis atópica, eccema y psoriasis. La dermatitis de contacto puede estar dirigida por las células de Langerhans que fagocitan el antígeno, migran a los ganglios linfáticos, presentan el antígeno y sensibilizan a las células T para la respuesta celular destructora intensa que ocurre en el sitio afectado de la piel (Kripke et al., 1987). Un ejemplo de dermatitis atópica es una enfermedad de la piel crónica inflamatoria con recaídas asociada con la colonización de la piel con S. aureus y se piensa que está causada por superantígenos derivados de S. aureus que desencadenan la inflamación crónica de la piel mediada por las células T a través de las células de Langerhans (Herz et al., 1998; Leung, 1995; Saloga et al., 1996a). La dermatitis atópica puede utilizar las células de Langerhans... [Seguir leyendo]

1. Formulación para la inmunización transcutánea que comprende un antígeno en forma seca y un adyuvante en forma seca, y por la cual la aplicación de la formulación en la piel intacta, sin perforar ésta, induce una respuesta inmune específica para el antígeno, en la que dicho adyuvante comprende una exotoxina bacteriana que ADPribosila o una subunidad de ésta que se une al gangliósido GM1. 2. Formulación según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno tiene un peso molecular mayor de 500 daltons. 3. Formulación según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno se obtiene de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en bacteria, virus, hongo y parásito. 4. Formulación según la reivindicación 3, en la que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en: Bacillus anthracis, Campylobacter, Vibrio cholerae, Clostridia incluyendo clostridium difficile, difteria, E: coli enterohemorrágica, E. coli enterotoxigénica, Giardia, gonococcus, Helicobacter pylori o ureasa producida por H. pylori, Hemophilus influenza B, Hemophilus influenza no tipificable, Legionella, meningococcus, Mycobacterium incluyendo aquellos organismos responsables de la tuberculosis, pertussis, pneumococcus, Salmonella, Shigella, Staphylococcus y sus enterotoxinas, streptococcus beta hemolíticos grupo A, Streptococcus B, tétanos, Borrelia burgdorfi y Yersinia. 5. Formulación según la reivindicación 3, en la que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en: adenovirus, dengue serotipos 1 a 4, ébola, enterovirus, virus hanta, hepatitis serotipos A a E, virus del herpes simple 1 ó 2, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del papiloma humano, influenza, sarampión, Norwalk, encefalitis equina japonesa, virus del papiloma, parvovirus B19, polio, rabia, virus respiratorio sincitial, rotavirus, rubéola, sarampión, encefalitis de St. Louis, vaccinia, vectores de expresión virales que contienen genes que codifican otros antígenos tales como los antígenos de la malaria, varicela y fiebre amarilla. 6. Formulación según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno es un antígeno tumoral o un autoantígeno. 7. Formulación según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno se selecciona del grupo que consiste en carbohidrato, glicolípido, glicoproteína, lípido, lipoproteína, fosfolípido y polipéptido. 8. Formulación según la reivindicación 1, en la que la formulación está comprendida por un virus vivo atenuado y al menos un antígeno es expresado por el virus vivo atenuado. 9. Formulación según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno es un polipéptido de más de 500 daltons de peso molecular. 10. Formulación según la reivindicación 1, en la que dicho antígeno es multivalente. 11. Formulación según la reivindicación 1, en la que una única molécula es tanto un adyuvante como un antígeno de la formulación. 12. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 ó 9-11, en la que la formulación no incluye un potenciador de la penetración, partícula viral, liposoma o lípido cargado. 13. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que la formulación sí incluye un potenciador químico de la penetración que incremente la eficacia de la inmunización en comparación con el uso de una formulación que carece del potenciador químico de la penetración. 14. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, por la cual la exposición de la piel intacta al adyuvante activa una célula de Langerhans subyacente. 15. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, por la cual la exposición de la piel intacta al adyuvante causa que una célula de Langerhans subyacente incremente la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II. 16. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, por la cual la exposición de la piel intacta al adyuvante causa la migración de una célula de Langerhans subyacente a un ganglio linfático. 17. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, por la cual la exposición de la piel intacta al adyuvante produce una señal para una célula de Langerhans subyacente para madurar en una célula presentadora de antígeno. 18. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, por la cual la exposición de la piel intacta al adyuvante incrementa la presentación del antígeno a los linfocitos. 19. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además un excipiente, estabilizador, desecante o conservante.   20. Formulación según la reivindicación 19, que comprende un conservante o estabilizador seleccionado del grupo que consiste en: sacarosa, manitol, sorbitol, trehalosa, dextrano y glicerina. 21. Formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que comprende además un apósito y se proporciona de esta manera una forma de parche de la formulación. 22. Formulación según la reivindicación 21, en la que el apósito es un apósito oclusivo. 23. Formulación según la reivindicación 21, en la que la piel intacta cubierta por el apósito tiene un área superficial que es mayor que al menos un campo de ganglios linfáticos de drenaje. 24. La formulación seca según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la inmunización transcutánea aplicando la formulación en la piel intacta de un sujeto sin perforar ésta, y que comprende la penetración potenciada de al menos un antígeno o adyuvante a través de la piel con al menos un potenciador físico o químico de la penetración aplicado en la piel antes, después y/o durante la aplicación de la formulación en la piel. 25. La formulación seca de la reivindicación 24, que comprende aplicar alcohol en, o hidratar, la piel intacta antes de la aplicación de la formulación. 26. Un método para producir una formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1-23 para la inmunización transcutánea que comprende: (a) proporcionar al menos un antígeno y al menos un adyuvante; (b) disolver al menos el antígeno y adyuvante para producir un líquido inmunológicamente activo; (c) secar el líquido inmunológicamente activo en un sustrato sólido para producir la formulación; (d) en el que al menos el antígeno y adyuvante están en forma seca al menos hasta que la formulación se aplica en la piel de un sujeto que se va a inmunizar y en el que el adyuvante comprende una exotoxina bacteriana que ADPribosila o una subunidad de ésta que se une al gangliósido GM1. 27. Un método según la reivindicación 26, que comprende además mezclar todos los ingredientes activos juntos para producir una formulación homogénea. 28. Un método según la reivindicación 26 ó 27, en el que la formulación está comprendida esencialmente por un ingrediente inmunológicamente activo. 29. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 26-28, en el que el sustrato sólido es un apósito y la formulación se proporciona de esta manera como un parche. 30. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 26-29, en el que la formulación se produce bajo condiciones asépticas adecuadas para la producción de una vacuna. 31. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 26-30, en el que una única aplicación de la formulación es suficiente para inducir una respuesta inmune específica de antígeno detectable. 32. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 26-31, en el que la formulación está comprendida además por al menos un excipiente, estabilizador, desecante o conservante. 41   42