Formulación líquida de hormona del crecimiento.

Una formulación líquida que comprende:

a) una hormona de crecimiento,

o una hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH), que estimula la liberación o potencia la actividad de la hGH endógena;

b) una sal de metal alcalino;

c) una sal de metal alcalino-térreo o una sal de metal pseudo-alcalino-térreo; y

d) una solución tampón de citrato/fosfato, en donde el pH de la formulación está en el intervalo de 5, 5 a 5, 8.

Formulación líquida de hormona del crecimiento Campo de la invención La presente invención se refiere a formulaciones líquidas de hormona de crecimiento (GH, por sus siglas en inglés) y, en particular, a formulaciones líquidas de hormona del crecimiento humana (hGH) con estabilidad química y física mejorada. Las formulaciones líquidas de hormona de crecimiento (GH) de la presente invención se pueden conservar durante periodos prolongados de tiempo a temperatura ambiente. La presente invención se refiere, adicionalmente, a un procedimiento para la preparación de tales formulaciones líquidas de GH, y a una forma de presentación de las mismas.

Antecedentes de la invención La hormona del crecimiento humana (hGH) , conocida también como somatropina (DCI) o somatotropina, es una hormona proteica producida y liberada por las células somatotropas de la pituitaria anterior. La hormona del crecimiento humana juega un papel clave en el crecimiento somático durante la infancia y en el metabolismo en la edad adulta a través de sus efectos sobre el metabolismo de proteínas, carbohidratos y lípidos.

La hormona del crecimiento humana es una cadena polipeptídica única de 191 aminoácidos (Bewly et al., 1972) con dos enlaces disulfuro, uno situado entre Cys-53 y Cys-165, que forma un bucle de gran tamaño en la molécula, y el otro entre Cys-182 y Cys-189, que forma un bucle pequeño, próximo al extremo C-terminal. Martial et al. (1979) dieron a conocer la secuencia de ADN que confirmó la secuencia de aminoácidos. La hGH purificada es un polvo blanco amorfo en su forma liofilizada. Es fácilmente soluble (concentraciones > 10 mg/l) en soluciones tampón acuosas a un pH dentro del intervalo de 6, 5 a 8, 5.

En solución, la hGH se presenta predominantemente en forma de monómero, con una pequeña fracción en forma de dímeros y oligómeros de mayor peso molecular. Bajo determinadas condiciones, es posible inducir a la hGH para formar cantidades mayores de dímeros, trímeros y oligómeros superiores.

Se conocen diversos derivados de hGH, incluidos los derivados de origen natural, variantes y productos metabólicos, productos de degradación principalmente de hGH biosintética y derivados de hGH tratados por métodos de ingeniería genética. GH-V, una variante de la hormona del crecimiento hallada en la placenta, es un ejemplo de derivado de la hGH de origen natural. En Chen et al. (1989) se describen otros miembros del locus génico.

La metionil-hGH fue la primera forma de hGH producida por tecnología de ADN recombinante. Este compuesto es, en realidad, un derivado de hGH con un residuo adicional de metionina en su extremo N-terminal (Goeddel et al., 1979) .

Se ha informado de que una variante de origen natural de hGH, llamada 20-K-hGH, aparece en la pituitaria así como en el torrente sanguíneo (Lewis et al., 1978; Lewis et al., 1980) . Este compuesto, que carece de los 15 residuos aminoácidos desde Glu-32 a Gln-46, surge de un empalme alternativo del ácido ribonucleico mensajero (DeNoto et al., 1981) . Este compuesto comparte numerosas, pero no todas las propiedades biológicas de hGH.

La 20-K-hGH se produce en la pituitaria y se libera a la sangre. Representa aproximadamente 5% de la producción de hormona del crecimiento del adulto y aproximadamente 20% de la producción de hormona del crecimiento en el niño. Posee la misma actividad promotora del crecimiento que la hormona del crecimiento de 22 kD, y se ha comunicado que su actividad lipolítica es igual o mayor que la de la hormona del crecimiento 22 kD. Se une a los receptores de hormona del crecimiento con la misma afinidad que la hormona del crecimiento 22 kD, y su bioactividad lactogénica (semejante a prolactina) es la décima parte de la correspondiente a la hormona 22 kD. A diferencia de la hormona 22 kD, la 20-k-hGH muestra una débil actividad anti-insulínica.

A partir de modificaciones proteolíticas de la molécula, han surgido numerosos derivados de hGH. La vía principal del metabolismo de hGH implica la proteólisis. La región de hGH alrededor de los residuos 130-150 es extremadamente susceptible a la proteólisis, y se han descrito varios derivados de hGH que tienen cortes y deleciones en esta región (Thorlacius-Ussing, 1987) . Esta región se encuentra en el bucle grande de hGH y la escisión de un enlace peptídico en la misma da como resultado la generación de dos cadenas que están conectadas a través del enlace disulfuro en Cys-53 y Cys-165. Se informa de que muchas de estas formas constituidas por dos cadenas tienen una actividad biológica aumentada (Singh et al., 1974) . Se han generado numerosos derivados de la hormona del crecimiento humana de manera artificial mediante el uso de enzimas. Se han empleado las enzimas tripsina y subtilisina, así como otras, para modificar la hGH en diversos puntos a lo largo de la molécula (Lewis et al., 1977; Graff et al., 1982) . Uno de estos derivados, denominado proteína anabólica de dos cadenas (2-CAP) , se formó por la proteólisis controlada de hGH usando tripsina (Becker et al., 1989) . Se ha demostrado que la 2-CAP posee propiedades biológicas muy diferentes de las de la molécula intacta de hGH, en el sentido de que conserva en gran medida la activi

dad promotora del crecimiento de hGH, en tanto que se ha abolido la mayor parte de los efectos sobre el metabolismo de carbohidratos.

Los residuos de asparagina y glutamina en las proteínas son susceptibles de experimentar reacciones de desamidación bajo condiciones apropiadas. Se ha demostrado que la hGH pituitaria sufre este tipo de reacción, dando como resultado la conversión de Asn-152 en ácido aspártico e, igualmente, aunque en menor grado, la conversión de Gln137 en ácido glutámico (Lewis et al., 1981) . Se ha comprobado que la hGH desamidada exhibe una susceptibilidad alterada a la proteólisis con la enzima subtilisina, lo que sugiere que la desamidación puede ser un factor fisiológico importante para dirigir la escisión proteolítica de hGH. Es sabido que la hGH biosintética se degrada bajo determinadas condiciones de conservación, con el resultado de una desamidación en una asparagina diferente (Asn-149) . Este es el lugar principal de desamidación, pero también se ha registrado la desamidación en Asn-152 (Becker et al., 1988) . En la hGH biosintética no se ha informado de desamidación en Gln-137.

Los residuos de metionina en las proteínas son susceptibles de oxidación, principalmente al sulfóxido. Tanto la hGH derivada de la pituitaria como la de origen biosintético experimentan sulfoxidaciones en Met-14 y Met-125 (Becker et al., 1988) . Asimismo, se ha comunicado la oxidación en Met-170 en la hGH pituitaria, pero no en la biosintética. Se ha comprobado que tanto la hGH desamidada como la Met-14 sulfóxido hGH exhiben plena actividad biológica (Becker et al., 1988) .

Se han producido formas truncadas de hGH, mediante la acción de enzimas o por métodos genéticos. En la 2-CAP, generada por la acción controlada de la tripsina, se eliminan los ocho primeros residuos del extremo N-terminal de la hGH. Se han producido otras versiones truncadas de hGH modificando el gen antes de la expresión en un hospedador apropiado. Se han eliminado los 13 primeros residuos para dar un derivado dotado de propiedades biológicas concretas (Gertier et al., 1986) , en el que la cadena de polipéptidos no está escindida.

Aunque originalmente la hormona del crecimiento humana se obtuvo de las glándulas pituitarias de cadáveres, estas preparaciones no estaban homogeneizadas por electroforesis y en el suero de pacientes tratados con preparaciones con una pureza del orden de 50% aparecían anticuerpos, atribuyéndose la inmunogenicidad a componentes inactivos. La tecnología de ADN recombinante permitió la producción de una cantidad ilimitada de hGH en una serie de sistemas diferentes. La purificación de hGH a partir del medio de cultivo se ve facilitada por la presencia de cantidades escasas de proteínas contaminantes. De hecho, se ha demostrado que se puede purificar la hGH a escala de laboratorio mediante una única etapa de purificación en una columna de HPLC de fase reversa (Hsiung et al., 1989) .

La compañía Serono International, S.A. produce hormona del crecimiento humana recombinante, rhGH, bajo el nombre SEROSTIM®, producto al que se ha concedido una aprobación acelerada de la FDA (Agencia de Alimentos y Medicamentos de EE.UU.) para tratar la pérdida de peso y la caquexia en pacientes con SIDA. SAIZEN® es la hormona del crecimiento humana recombinante indicada en el déficit de GH en niños,... [Seguir leyendo]

1. Una formulación líquida que comprende: a) una hormona de crecimiento, o una hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH) , que estimu

la la liberación o potencia la actividad de la hGH endógena; b) una sal de metal alcalino; c) una sal de metal alcalino-térreo o una sal de metal pseudo-alcalino-térreo; y d) una solución tampón de citrato/fosfato, en donde el pH de la formulación está en el intervalo de 5, 5 a 5, 8.

2. La formulación según la reivindicación 1, en la que la hormona de crecimiento es hormona del crecimiento humana.

3. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la sal de metal alcalino se selecciona del grupo consistente en NaCl, KCl, Na2SO4, Na2CO3.

4. La formulación según la reivindicación 3, en la que la sal de metal alcalino es NaCl o Na2SO4.

5. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la sal de metal alcalino-térreo se selecciona del grupo consistente en CaCl2, MgCl2, MgSO4, NH4CO3.

6. La formulación según la reivindicación 5, en la que la sal alcalino-térrea es MgCl2.

7. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la solución tampón es una solución tampón de citrato sódico/fosfato sódico.

8. La formulación según la reivindicación 7, en la que la solución tampón está en una concentración en el intervalo de 1 a 100 mM, o de 5 a 50 mM, o de 10 a 20 mM.

9. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende adicionalmente un tensioactivo.

10. La formulación según la reivindicación 9, en la que el tensioactivo es un polietilen-polipropilenglicol.

11. La formulación según la reivindicación 10, en la que el tensioactivo es Pluronic F68.

12. La formulación según las reivindicaciones 10 u 11, que comprende el polietilen-polipropilenglicol en una concentración dentro del intervalo de 0, 5 a 5 mg/ml, o 1 a 2 mg/ml, o 1, 5 mg/ml.

13. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende adicionalmente un estabilizador.

14. La formulación según la reivindicación 13, en la que el estabilizador es sacarosa.

15. La formulación según la reivindicación 14, que comprende sacarosa en una concentración dentro del intervalo de 10 mg/ml a 100 mg/ml, o 20 mg/ml a 80 mg/ml, o aproximadamente 60 mg/ml.

16. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende adicionalmente un conservante.

17. Una formulación según la reivindicación 16, que comprende el conservante en una concentración dentro del intervalo de 1 a 10 mg/ml, o 2 a 5 mg/ml, o 3 mg/ml.

18. La formulación según las reivindicaciones 16 o 17, en la que el conservante es fenol.

19. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde dicha formulación tiene un pH de 5, 8 y consiste en r-hGH, citrato sódico/fosfato sódico, Na2SO4, MgCl2, fenol, Pluronic F68 y, opcionalmente, agua para inyección.

20. La formulación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde dicha formulación tiene un pH de 5, 8 y consiste en r-hGH, citrato sódico/fosfato sódico, NaCl, MgCl2, fenol, Pluronic F68 y, opcionalmente, agua para inyección.

21. Una composición farmacéutica que comprende la formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

22. Una forma de presentación de la formulación líquida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, conta nida herméticamente bajo condiciones de esterilidad en un envase apropiado para la conservación antes del uso. 17

23. Uso de una formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la preparación de un medicamento para tratar el déficit de GH en niños, la pérdida de peso y caquexia en pacientes con SIDA, el síndrome de Turner en niñas, así como en la insuficiencia renal crónica en niños.

24. Uso de una formulación según la reivindicación 23, en el que el medicamento es para la administración monodo5 sis.

25. Uso de una formulación según la reivindicación 23, en el que el medicamento es para la administración multidosis.