Expresión recombinante de proteínas en una forma bicatenaria, con puente disulfuro.

Procedimiento para la producción de polipéptidos o proteínas en forma bicatenaria en las que las dos cadenas están unidas por puente disulfuro por medio de expresión recombinante en células huésped de E.

coli, en el que

(i) el polipéptido o la proteína ejerce su actividad biológica como polipéptido o proteína bicatenaria con puente disulfuro.

(ii) el resto de aminoácido C terminal de la primera cadena es un resto de aminoácido básico;

(iii) la segunda cadena de la proteína/del polipéptido presenta de manera N terminal en la dirección N-C de 1 a restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr; y

(iv) el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) modificar el polipéptido o la proteína, al nivel de ácido nucleico, de modo que el polipéptido o la proteína en su forma modificada en su región de bucle presente la secuencia VPXGS y en dirección N terminal de esta secuencia PRS a una distancia de 1 a 20 restos de aminoácido un resto de aminoácido básico, siendo X, V, P, G y S tal como se definen anteriormente, y estando definida la región de bucle como la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre los dos restos de cisteína que participan en el puente disulfuro;

(b) introducir el constructo modificado al nivel de ácido nucleico en células de E. coli;

(c) cultivar y a continuación lisar las células huésped; y

(d) aislar el polipéptido o la proteína bicatenaria con puente disulfuro.

Expresión recombinante de proteínas en una forma bicatenaria, con puente disulfuro Un objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de proteínas en forma bicatenaria por medio de expresión recombinante en células huésped de E. coli. Otro aspecto de la presente invención se refiere a proteínas o polipéptidos en forma bicatenaria y biológicamente activa que pueden producirse por medio del procedimiento mencionado.

La ventaja esencial con respecto a proteínas/polipéptidos recombinantes correspondientes que no presentan las características según la invención consiste en que no deben tratarse con una proteasa específica para la escisión dirigida de la cadena de polipéptido, de modo que se simplifica esencialmente el procedimiento de producción. Otros objetos de la presente invención son ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos/las proteínas según la invención, vectores que contienen tales ácidos nucleicos o secuencias de ácido nucleico, células huésped que contienen a su vez los vectores mencionados y por último preparaciones farmacéuticas que contienen las proteínas/los polipéptidos bicatenarios y biológicamente activos.

Las neurotoxinas clostridiales son fuertes inhibidores de la secreción de neurotransmisores dependientes del calcio en células neuronales. Tras la ingestión oral de toxinas botulínicas (BoNT) , por ejemplo a través de alimentos en mal estado se produce un cuadro clínico denominado como botulismo, que se caracteriza por la parálisis de distintos músculos. Una parálisis de la musculatura respiratoria puede llevar en último lugar a la muerte del afectado. A este respecto se interrumpe la transmisión de señales del nervio al músculo en la placa terminal motora, dado que las neuronas motoras ya no pueden distribuir nada de acetilcolina. Las toxinas botulínicas muestran su efecto inhibidor mediante la escisión proteolítica de proteínas que participan en los procesos de secreción, las denominadas proteínas SNARE. A este respecto las neurotoxinas de distintos serotipos tienen diferentes especificidades con respecto a las proteínas SNARE y los sitios de escisión en las respectivas secuencias de aminoácidos. BoNT (A) y BoNT (E) escinden la proteína SNARE SNAP-25, mientras que BoNT (C) reconoce tanto SNAP-25 como sintaxina-1 como sustrato. Por último, las toxinas de los serotipos B, D, F y G así como la toxina tetánica (TeNT) escinden VAMP-2 (sinaptobrevina-2) (Schiavo y col., 1997) .

En el caso de las neurotoxinas clostridiales se trata de los venenos conocidos más potentes. Así, la dosis letal administrada por vía intravenosa, a la que mueren de botulismo la mitad de todos los ratones del grupo de dosis, asciende únicamente a 5 pg. El hecho de que las toxinas de la mayoría de los serotipos actúen también por vía oral, ha de atribuirse a proteínas complejas en las que están encapsuladas y que protegen por lo tanto en el paso gastrointestinal frente a la degradación por enzimas digestivas. A ellas se atribuye también una función en la reabsorción de las toxinas por el epitelio del intestino delgado (Fujinaga, 1997) .

En el transcurso de las últimas décadas se han aprovechado terapéuticamente las toxinas botulínicas de los serotipos A y B. Así, mediante la inyección controlada de sólo pequeñas dosis se relajan músculos individuales, crónicamente contraídos. Una ventaja especial es la larga duración de efecto de por ejemplo BoNT (A) y BoNT (B) durante tres a seis meses. Las primeras áreas de indicación han sido, entre otras, distonías tales como tortícolis, blefaroespasmo y estrabismo, han de sumarse otras tales como la hiperhidrosis o tratamientos cosméticos para el suavizado de arrugas. El mercado para la toxina butulínica como agente terapéutico crece rápidamente, no en último termino por el desarrollo de otras áreas de indicación y el aprovechamiento intensivo en aplicaciones ya existentes. A este respecto se están haciendo esfuerzos para mejorar las propiedades de las neurotoxinas con respecto a la duración de acción, la fuerza de acción y el potencial antigénico. Ensayos han mostrado que las proteínas complejas que están contenidas en las preparaciones comercialmente disponibles hasta el momento (BOTOX de Allergan y Dysport de Ipsen-Beaufort como preparaciones de BoNT (A) así como Myobloc/Neurobloc de Elan como preparación de BoNT (B) ) , no tienen ningún efecto positivo sobre la duración y la intensidad de acción, pero debido a la mayor cantidad de proteína en comparación con una preparación de la neurotoxina pura con la misma actividad, pueden contribuir a desencadenar una reacción inmunitaria en el paciente que puede hacer ineficaces inyecciones adicionales.

Es decir, dado que las proteínas complejas no se necesitan en la formulación de principio activo e incluso son desventajosas y algunas modificaciones para la mejora de las propiedades sólo pueden conseguirse mediante rutas de ingeniería genética, existe una gran necesidad de producir las neurotoxinas de manera recombinante, por ejemplo mediante expresión en Escherichia coli (las neurotoxinas así generadas están libres de las proteínas complejas mencionadas anteriormente) . Además se explotarán nuevas áreas de indicación de manera que se confiera a las toxinas botulínicas una especificidad celular distinta. Para ello se preferirá también la ruta a través de una toxina recombinante o un derivado de toxina.

Las toxinas botulínicas así como la toxina tetánica presentan altas homologías en su secuencia de aminoácidos y se asemejan especialmente en su estructura de dominios. Están compuestas por un dominio de unión a receptor (HC) , un dominio de translocación (HN) y una subunidad catalítica (L) , que en la célula nerviosa provoca la escisión de la proteína SNARE correspondiente. HC es responsable de la unión específica de las neurotoxinas a las placas terminales motoras, mientas que el dominio de translocación se ocupa de que L llegue desde los endosomas hasta el citoplasma de las neuronas. HN (extremo N terminal) y HC (extremo C terminal) forman la cadena pesada de 100

kDa, mientras que L es la cadena ligera y constituye la subunidad catalítica de 50 kDa. Ambas cadenas de polipéptido están unidas entre sí mediante un puente disulfuro. Entre los restos de cisteína implicados se extiende una región de conector o de bucle (sinónimos de ellos también secuencia de conector o secuencia de bucle o de forma simplificada conector o bucle) , cuya longitud entre las toxinas botulínicas de los serotipos individuales varía considerablemente. A más tardar durante la liberación de las toxinas de los clostridios en el curso de la lisis celular se escinde el bucle mediante una endopeptidasa clostridial no caracterizada hasta el momento, variando la relación de especies escindidas y no escindidas entre los serotipos. Para la actividad de las neurotoxinas, es esencial la escisión del bucle con respecto a la toxina bicatenaria (Schiavo y col., 1997) . Por ejemplo, en el caso de la neurotoxina botulínica A se corta un decapéptido del bucle, es decir, en la secuencia de bucle VRGIITSKTKSLDKGYNKALNDL, que tiene de manera N terminal así como C terminal un resto de cisteína como vecinos inmediatos, no se corta sólo una unión peptídica, sino que se corta dos veces de forma proteolítica. Por lo tanto el peso molecular de la neurotoxina botulínica A biológicamente se encuentra por naturaleza por debajo del de la toxina originalmente traducida por clostridios.

Dado que la proteasa clostridial no está presente en otros organismos huésped tales como Escherichia coli, en ellos se expresan toxinas botulínicas recombinantes y sus fragmentos o derivados como polipéptidos monocatenarios. Esto es válido de manera correspondiente también para cualquier otra proteína que ejerza su actividad biológica/bioquímica normal como proteína bicatenaria: en general tales proteínas se obtienen por medio de la tecnología de ADN recombinante como proteínas monocatenarias, su actividad biológica/bioquímica, que ejercen de manera natural como proteínas bicatenarias, no está por lo tanto apenas presente o no lo está en absoluto.

Para generar una proteína activa, especialmente una toxina butulínica activa, es necesaria por lo tanto hasta el momento la incorporación de una secuencia de reconocimiento para una proteasa específica de secuencia tal como por ejemplo trombina, factor Xa o genenasa, de modo que tras la purificación puede realizarse una escisión y con ello una activación mediante la adición de una de estas endoproteasas. Esto se describe por ejemplo en el documento WO 2004/024909. El uso... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de polipéptidos o proteínas en forma bicatenaria en las que las dos cadenas están unidas por puente disulfuro por medio de expresión recombinante en células huésped de E. coli, en el que

(i) el polipéptido o la proteína ejerce su actividad biológica como polipéptido o proteína bicatenaria con puente disulfuro.

(ii) el resto de aminoácido C terminal de la primera cadena es un resto de aminoácido básico;

(iii) la segunda cadena de la proteína/del polipéptido presenta de manera N terminal en la dirección N-C de 1 a 20 restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr; y (iv) el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) modificar el polipéptido o la proteína, al nivel de ácido nucleico, de modo que el polipéptido o la proteína en su forma modificada en su región de bucle presente la secuencia VPXGS y en dirección N terminal de esta secuencia PRS a una distancia de 1 a 20 restos de aminoácido un resto de aminoácido básico, siendo X, V, P, G y S tal como se definen anteriormente, y estando definida la región de bucle como la secuencia de aminoácidos que se encuentra entre los dos restos de cisteína que participan en el puente disulfuro;

(b) introducir el constructo modificado al nivel de ácido nucleico en células de E. coli;

(c) cultivar y a continuación lisar las células huésped; y

(d) aislar el polipéptido o la proteína bicatenaria con puente disulfuro.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el resto de aminoácido básico en (ii) es un resto de Arg o Lys.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la primera cadena del polipéptido/de la proteína es la cadena ligera del polipéptido/de la proteína y la segunda cadena es la cadena pesada del polipéptido/de la proteína, especialmente en el que la proteína es una proteína híbrida.

4. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido o la proteína es una neurotoxina botulínica, especialmente la neurotoxina botulínica del serotipo A (BoNT (A) ) , y especialmente el fragmento LHN de BoNT (A) .

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que la secuencia PRS VPXGS se inserta entre los aminoácidos Leu442 y Lys448 de BoNT (A) con la deleción de los aminoácido.

44. 447, insertándose especialmente la secuencia PRS VPRGS, VPYGS, VPHGS o VPQGS.

6. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia PRS VPXGS se inserta en el octapéptido Lys438 - Ile445 de BoNT (B) , en el 15-mero His438 - Asp452 de BoNT (C1) o en el 13-mero Lys413 - Ile425 de BoNT (E) con la deleción de al menos un aminoácido, insertándose especialmente la secuencia PRS VPXGS en forma del 17-mero GIITSKTKSLVPRGSKA o del 18-mero RGIITSKTKSLVPRGSKA.

7. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la proteína híbrida presenta los siguientes componentes A, B y C:

- un dominio efector que, mediante su actividad enzimática, puede inhibir la secreción en células diana o destruir las mismas o un dominio de toxina (componente A) ;

- una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B) , así como

- un dominio de unión celular que confiere a la proteína de fusión/híbrida una especificidad celular (componente C) ; y el componente D opcional:

- un dominio de translocación.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que el dominio de toxina (A) es el dominio de la toxina diftérica, de la exotoxina de Pseudomonas o de ricina, especialmente en el que el dominio de toxina (A) es el fragmento PE40 (dominio III, dominio II y dominio Ib) o el fragmento PE38 (dominio III y dominio II) de la exotoxina de Pseudomonas o la cadena A de ricina.

9. El procedimiento según la reivindicación 7 u 8, en el que el dominio de unión celular (C) es un anticuerpo monoclonal, una afilina, una proteína de repetición de anquirina, una anticalina, un factor de crecimiento tal como TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF-1 o una citocina tal como IL2, IL4 o IL6.

10. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que la proteína híbrida presenta los siguientes componentes A, B y C:

- una proteína o un oligopéptido que confiere a la proteína de fusión una mejor solubilidad, provoca una mayor tasa de expresión y/o posibilita una purificación por afinidad (componente A) ,

- una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B) , así como

- un polipéptido cualquiera (componente C) .

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que el componente A es la glutatión-S-transferasa (GST) , la proteína de unión a maltosa (MBP) , una marca de His, una marca Strep o una marca FLAG.

12. El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que las células de E. coli son células K12 de

E. coli, especialmente células K12 de E. coli de las cepas M15[pREP4], XL1-BLUE o UT5600.

13. Polipéptido o proteína, encontrándose el polipéptido/la proteína como polipéptido/proteína bicatenaria con puente disulfuro y siendo biológicamente activo, caracterizado porque el extremo C terminal de la primera cadena del polipéptido/de la proteína es un resto de aminoácido básico y la segunda cadena del polipéptido/de la proteína presenta de manera N terminal en la dirección N-C de 1 a 20 restos de aminoácido y una secuencia de pentapéptido VPXGS denominada como PRS, en la que X significa cualquier aminoácido de origen natural, en la que V significa Val, Leu, Ile, Ala, Phe, Pro o Gly, en la que P significa Pro, Leu, Ile, Ala, Phe, Val o Gly, en la que G significa Gly, Leu, Ile, Ala, Pro, Phe o Val y en la que S significa Ser, Tyr, Trp o Thr.

14. El polipéptido o la proteína según la reivindicación 13, en el que el resto de aminoácido básico es un resto de Arg

o Lys.

15. El polipéptido o la proteína según la reivindicación 13 ó 14, en el que la primera cadena del polipéptido/de la proteína es la cadena ligera del polipéptido/de la proteína y la segunda cadena es la cadena pesada del polipéptido/de la proteína, especialmente en el que el extremo C terminal de la primera cadena es un resto de Lys.

16. El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la segunda cadena presenta de manera N terminal la secuencia de pentapéptido VPXGS, la secuencia de hexapéptido XVPXGS o la secuencia de heptapéptido XXVPXGS.

17. El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13, 14 y 16, siendo el polipéptido/la proteína una neurotoxina botulínica, un derivado o un fragmento de la neurotoxina botulínica, especialmente el fragmento LHN, o presenta la actividad biológica de una neurotoxina botulínica, especialmente siendo el polipéptido/la proteína la neurotoxina botulínica del serotipo A (BoNT (A) ) o presentando la actividad biológica de BoNT (A) , especialmente, siendo el polipéptido o la proteína el fragmento LHN de BoNT (A) o presentando la actividad biológica del fragmento LHN de BoNT (A) .

18. El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la segunda cadena de manera N terminal presenta la secuencia de heptapéptido SLVPXGS, especialmente en la que X es R, Y, H o Q.

19. El polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 16 ó 18, siendo la proteína una proteína híbrida, especialmente presentando la proteína híbrida los siguientes componentes A, B y C:

- un dominio efector que, mediante su actividad enzimática, puede inhibir la secreción en células diana o destruir las mismas o un dominio de toxina (componente A) ;

- una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B) , así como un dominio de unión celular que confiere a la proteína de fusión/híbrida una especificidad celular (componente C) ; y el componente D opcional:

un dominio de translocación

20. El polipéptido o la proteína según la reivindicación 19, en el que el dominio de toxina (A) es el dominio de la toxina diftérica, de la exotoxina de Pseudomonas o de ricina, especialmente en el que el dominio de toxina (A) es el fragmento PE40 (dominio III, dominio II y dominio Ib) o el fragmento PE38 (dominio III y dominio II) de la exotoxina de Pseudomonas o la cadena A de ricina.

21. El polipéptido o la proteína según la reivindicación 19 ó 20, en el que el dominio de unión celular (C) es un anticuerpo monoclonal, una afilina, una proteína de repetición de anquirina, una anticalina, un factor de crecimiento tal como TGF-alfa, FGF, VEGF o IGF-1 o una citocina tal como IL2, IL4 o IL6.

22. El polipéptido o la proteína según la reivindicación 19, presentando la proteína híbrida los siguientes componentes A, B y C:

- una proteína o un oligopéptido que confiere a la proteína de fusión una mejor solubilidad, provoca una mayor tasa de expresión y/o posibilita una purificación por afinidad (componente A) ,

- una secuencia de bucle que presenta la secuencia VPXGS (componente B) , así como

- un polipéptido cualquiera (componente C) , especialmente en el que el componente A es la glutatión-Stransferasa (GST) , la proteína de unión a maltosa (MBP) , una marca de His, una marca Strep o una marca FLAG.

23. Preparación farmacéutica que comprende el polipéptido o la proteína según una de las reivindicaciones 13 a 22.