EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE DEFENSINAS DE INSECTO EN ASPERGILLUS.

Expresión recombinante de defensinas de insecto en Aspergillus Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a la expresión recombinante de péptidos antimicrobianos de defensina de insecto en Aspergillus. Estado de la técnica [0002] Las defensinas pertenecen a una clase de péptidos antimicrobianos pequeños. Éstos son capaces de matar un amplio espectro de microorganismos, algunos de los cuales se están volviendo cada vez más resistentes frente a antibióticos tradicionales. Por esta razón, es también cada vez más interesante el ser capaz de producir defensinas en cantidades grandes a un bajo coste. [0003] Dado que las defensinas normalmente sólo comprenden de 30-50 residuos de aminoácidos, éstas son frecuentemente difíciles de producir eficazmente usando métodos de fermentación recombinante. La síntesis química de péptidos es un método alternativo, pero es también costoso cuando los péptidos exceden los 25-30 residuos de aminoácidos. Otra complicación es que las defensinas comprenden un patrón de cisteína distintivo, que es difícil de crear por síntesis química. [0004] Por consiguiente, es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos para la obtención de niveles mejorados de expresión de péptidos antimicrobianos de defensina de insecto en la fermentación recombinante de Aspergillus. Resumen de la invención [0005] Los inventores de la presente invención han descubierto que insertando una o más secuencias de intrón en un constructo de ácido nucleico, que dirige la expresión de una defensina de insecto, el nivel de expresión recombinante se puede mejorar en más de un 50% en comparación con el uso de un constructo de ácido nucleico sin secuencias de intrón. La secuencia(s) de intrón se puede insertar en cualquier lugar del constructo de ácido nucleico, tal como en la secuencia que codifica la defensina madura, o incluso en una secuencia que codifica un péptido señal. [0006] Por consiguiente, la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante de Aspergillus, comprendiendo un constructo de ácido nucleico, comprendiendo este constructo de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico foránea que codifica una defensina de insecto y una o más secuencia(s) de intrón. [0007] En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para la producción recombinante de una defensina de insecto en una célula huésped de Aspergillus, que incluye el cultivo de la célula huésped de Aspergillus comprendiendo un constructo de ácido nucleico, comprendiendo este constructo de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de defensina de insecto y una o más secuencia(s) de intrón, y recuperación del péptido de defensina de insecto. [0008] En un tercer aspecto, la invención se refiere al uso de un constructo de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de defensina de insecto y una o más secuencia(s) de intrón, para mejorar el nivel de expresión recombinante de la defensina de insecto en una célula huésped de Aspergillus. Definiciones [0009] Actividad antimicrobiana: el término "actividad antimicrobiana" se define aquí como una actividad que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de células microbianas. En el contexto de la presente invención el término "antimicrobiano" se refiere a que hay un efecto bactericida y/o bacteriostático y/o fungicida y/o fungistático y/o un efecto virucida, donde el término "bactericida" debe entenderse como capaz de matar células bacterianas. El término "bacteriostático" debe ser entendido como capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, es decir, inhibir células bacterianas en crecimiento. El término "fungicida" debe entenderse como capaz de matar células fúngicas. El término "fungistático" debe entenderse como capaz de inhibir el crecimiento fúngico, es decir, inhibir células fúngicas en crecimiento. El término "virucida" debe entenderse como capaz de inactivar virus. El término "células microbianas" denota células bacterianas o fúngicas (incluyendo levaduras). 2   [0010] En el contexto de la presente invención el término "inhibición del crecimiento de células microbianas" se refiere a que las células están en el estado de no crecimiento, es decir, que no son capaces de propagarse. [0011] Para fines de la presente invención, la actividad antimicrobiana se puede determinar según el procedimiento descrito por Lehrer y colaboradores, Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) págs. 167-174 (1991). Alternativamente, la actividad antimicrobiana se puede determinar según las directrices de NCCLS del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, antes conocido como National Committee for Clinical and Laboratory Standards). [0012] Las defensinas con actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Escherichia coli (DSM 1576) a 1/100 después de 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20°C en una solución acuosa de 25%(p/p), preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p), más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p), incluso más preferiblemente en una solución acuosa de 1%(p/p), de la forma más preferible en una solución acuosa de 0,5%(p/p), y en particular en una solución acuosa de 0,1%(p/p) de las defensinas con actividad antimicrobiana. [0013] Las defensinas con actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir la excrecencia de Escherichia coli (DSM 1576) durante 24 horas a 25°C en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm, preferiblemente cuando se añade en una concentración de 500 ppm, más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm, incluso más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm, más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 50 ppm, y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm. [0014] Las defensinas con actividad antimicrobiana pueden ser capaces de reducir el número de células vivas de Bacillus subtilis (ATCC 6633) a 1/100 después 8 horas (preferiblemente después de 4 horas, más preferiblemente después de 2 horas, de la forma más preferible después de 1 hora, y en particular después de 30 minutos) de incubación a 20°C en una solución acuosa de 25%(p/p), preferiblemente en una solución acuosa de 10%(p/p), más preferiblemente en una solución acuosa de 5%(p/p), incluso más preferiblemente en una solución acuosa de 1 %(p/p), de la forma más preferible en una solución acuosa de 0,5%(p/p), y en particular en una solución acuosa de 0,1%(p/p) de las defensinas con actividad antimicrobiana. [0015] Las defensinas con actividad antimicrobiana también pueden ser capaces de inhibir la excrecencia de Bacillus subtilis (ATCC 6633) durante 24 horas a 25°C en un sustrato de crecimiento microbiano, cuando se añade en una concentración de 1000 ppm, preferiblemente de cuando se añade en una concentración de 500 ppm, más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 250 ppm, incluso más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 100 ppm, más preferiblemente cuando se añade en una concentración de 50 ppm, y en particular cuando se añade en una concentración de 25 ppm. [0016] Las defensinas tienen como mínimo un 20%, preferiblemente al menos un 40%, más preferiblemente al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente al menos un 80%, incluso más preferiblemente al menos un 90%, de la forma más preferible al menos un 95%, e incluso de la forma más preferible al menos un 100% de la actividad antimicrobiana de la defensina que consiste en la secuencia de aminoácido mostrada como aminoácidos 1 a 42 de la SEC ID NO:2. [0017] ADNc: el término "ADNc" se define aquí como una molécula de ADN que puede estar preparada por transcripción inversa de una molécula de ARNm madura, unida, obtenida a partir de una célula eucariótica. El ADNc carece de las secuencias de intrón que normalmente están presentes en el ADN genómico correspondiente. La transcripción principal inicial de ARN es un precursor de ARNm que se procesa a través de una serie de pasos antes de que aparezca como ARNm maduro unido. Estos pasos incluyen la eliminación de secuencias de intrón por un proceso llamado empalme. El ADNc se deriva de la falta de ARNm, por lo tanto, de cualquier secuencia de intrón. [0018] Constructo de ácido nucleico: el término "constructo de ácido nucleico" como se utiliza en este caso se refiere a una molécula de ácido nucleico, bien monocatenaria o bicatenaria, que está aislada de un gen de origen natural o que... [Seguir leyendo]

1. Célula huésped recombinante de Aspergillus, comprendiendo un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico foránea que codifica una defensina de insecto y una o más secuencia(s) de intrón. 2. Célula huésped de Aspergillus según la reivindicación 1, que es una célula huésped de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. 3. Método para la producción recombinante de una defensina de insecto en una célula huésped de Aspergillus, que incluye cultivo de la célula huésped de Aspergillus comprendiendo un constructo de ácido nucleico, comprendiendo dicho constructo de ácido nucleico una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de defensina de insecto y una o más secuencia(s) de intrón, y recuperación del péptido de defensina de insecto. 4. Método según la reivindicación 3, donde la célula huésped de Aspergillus es una célula huésped de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3-4, que incluye la selección de una célula huésped que exhibe una producción de la defensina en una cantidad de al menos 150% de la cantidad obtenida cuando se usa un constructo de ácido nucleico sin secuencia de intrón. 6. Uso de un constructo de ácido nucleico, comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de defensina de insecto y una o más secuencia(s) de intrón, para mejorar el nivel de expresión recombinante de la defensina de insecto en una célula huésped de Aspergillus. 7. Uso según la reivindicación 6, donde la célula huésped de Aspergillus es una célula huésped de Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.