Un polinucleótido lineal aislado para la integración en un cromosoma,

que comprende:

a. una isla de CpG sin metilación extendida,

b. un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

c. un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y loscomponentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleicoexpresable, marcador seleccionable, en la orientación 5' a 3` con respecto a la cadena sentido del ácido nucleicoexpresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3' del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb delextremo proximal del marcador seleccionable.

Expresión génica mejorada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un elemento de apertura de la cromatina ubicuo (UCOE) , junto con un elemento de marcador seleccionable. Cuando está unido operablemente y además flanquea una secuencia de ácido nucleico expresable, la combinación de elementos proporciona unos altos niveles reproducibles de expresión génica. La presente invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia polinucleotídica, a una célula hospedante que comprende el vector y al uso del polinucleótido, del vector o de la célula hospedante en terapia, o para aplicaciones que implican la expresión de proteínas en cultivos celulares.

Antecedentes de la invención

El actual modelo de estructura de la cromatina en eucariotas superiores postula que los genes están organizados en “dominios” (Dillon, N. y Grosveld, F., Chromatin domains as potential units of eukar y otic gene function, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 260-264 (1994) ; Higgs, D.R., Do LCRs open chromatin domains?, Cell, 95, 299-302 (1998) ) . Se piensa que los dominios de cromatina existen en un estado condensado, “cerrado” y transcripcionalmente silencioso,

o en una configuración descondensada, “abierta” y transcripcionalmente competente. El establecimiento de una estructura de cromatina abierta caracterizada por una mayor sensibilidad a la ADNasa I, la hipometilación del ADN y la hiperacetilación de histonas, se considera un prerrequisito para el comienzo de la expresión génica.

La naturaleza abierta y cerrada de las regiones de cromatina se refleja en el comportamiento de transgenes integrados de modo aleatorio en el genoma de la célula hospedante. Construcciones idénticas producen patrones diferentes de expresión específica de tejido y específica de la etapa del desarrollo cuando se integran en diferentes localizaciones en el genoma del ratón (Palmiter, R.D. y Brinster, R.L., Ann. Ref. Genet., 20, 465-499 (1986) ; Allen,

N.D. et al., Nature, 333, 852-855 (1988) ; Bonnerot, C., Grimber, G., Briand, P. y Nicholas, J.F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6331-6335 (1990) ) .

Tambien se observa con frecuencia un patrón de expresión variegado dentro de un tejido de ratón transgénico concreto, conocido como variegación por efecto de la posición (PEV) (Kloussis, D. y Festenstein, R., Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 614-619 (1997) ) . Cuando se integran genes exógenos en el cromosoma de cultivos de células de mamífero in vitro, muchos de los acontecimientos de integración producen un rápido silenciamiento del transgén, y el resto muestra una gran variabilidad en los niveles de expresión (Pikaart, M.J., Recillas-Targa, F. y Feisenfield, G., Genes Dev., 12, 2852-2862 (1998) ; Fussenegger, M., Bailey, J.E., Hauser, H. y Mueller, P.P., Trends Biotech., 17, 35-42 (1999) ) . Estos efectos de la posición hacen que la expresión del transgén sea ineficaz, con implicaciones en la investigación básica y en aplicaciones biotecnológicas.

El modelo de organización génica de dominios de cromatina sugiere que los elementos de control genéticos que son capaces de establecer y mantener una estructura de la cromatina abierta transcripcionalmente competente deben estar asociados con regiones activas del genoma.

Las regiones de control de locus (LCR) son una clase de elementos reguladores transcripcionales con una capacidad de remodelación de la cromatina de largo alcance. Las LCR están funcionalmente definidas en ratones transgénicos por su capacidad para conferir unos niveles de expresión fisiológicos, dependientes del número de copias del transgén e independientes de sitio de integración, a un gen unido en cis, en especial transgenes de una sola copia (Fraser, P. y Grosveld, F., Curr. Opin. Cell Biol., 10, 361-365 (1998) ; Li, Q., Harju, S. y Peterson, K.R., Trends Genet., 15:403-408 (1999) ) . De forma crucial, esta expresión es específica de tejido. Las LCR son capaces de bloquear la propagación de la heterocromatina, evitar la PEV (Kioussis, D. y Festenstein, R., Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 614-619 (1997) ) , y consisten en una serie de sitios hipersensibles (HS) a la ADNasa I que también pueden estar 5’ o 3’ de los genes que regulan (Li, Q., Harju, S. y Peterson, K.R., Trends Genet., 15:403-408 (1999) ) .

Parece que las LCR están formadas por dos componentes separados aunque no necesariamente independientes: el primero, el establecimiento de un “dominio de cromatina abierta”, y el segundo una capacidad de activación transcripcional dominante para conferir una expresión dependiente del número de copias del transgén (Fraser, P. y Grosveld, F., Curr. Opin. Cell Biol., 10, 361-365 (1998) ) . Los mecanismos moleculares mediante los cuales las LCR ejercen su función siguen siendo objeto de discusión (Higgs, D.R., Cell, 95, 299-302 (1998) ; Bulger, M. y Groudine, M., Genes Dev., 13, 2465-2477 (1999) ; Grosveld, F., Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 152-157 (1999) ; Bender, M.A., Bulger, M., Close, J. y Groudine, M., Mol. Cell, 5, 387-393 (2000) ) .

La generación de líneas celulares de mamífero cultivadas que producen altos niveles de un producto de proteína terapéutica es un importante industria en desarrollo. Los efectos de posición de la cromatina hacen que sea un proceso difícil, caro y largo. La estrategia que se emplea más habitualmente para la producción de dichas “fábricas celulares” de mamífero se basa en la amplificación de genes inducida por una combinación de un gen de resistencia a un fármaco (por ejemplo, DHFR, glutamina sintetasa (Kaufman, R.J., Methods Enzymol., 185, 537-566 (1990) ) , y el mantenimiento de una presión selectiva rigurosa. El uso de vectores que contienen LCR de dominios de genes altamente expresados, utilizando células derivadas del tejido apropiado, simplifica mucho el procedimiento, produciendo una gran proporción de líneas celulares clonales que muestran unos altos niveles de expresión estable (Needham, M., Gooding, C., Hudson, K., Antoniou, M., Grosfeld, F. y Hollis, M., Nucleic Acids Res., 20, 997-1003 (1992) ; Needham, M., Egerton, M., Millest, A., Evans, S., Popplewell, M., Cerillo, G., McPheat, J., Monk, A., Jack, A., Johnstone, D. y Hollis, M., Protein Expr. Purif., 6, 124-131 (1995) ) .

Sin embargo, la especificidad de tejido de las LCR, aunque es útil es algunas circunstancias, también es una importante limitación para muchas aplicaciones, por ejemplo cuando no se conoce ninguna LCR para el tejido en el que se requiere la expresión, o cuando se requiere la expresión en muchos o en todos los tejidos.

Las solicitudes de patentes de los inventores en tramitación junto con la presente PCT/GB99/02357 (documento WO 00/05393) , US 09/358082, GB 0022995.5 y US 60/252.048, incorporadas como referencia en la presente, describen elementos que son responsables, en su contexto cromosómico natural, de establecer una estructura de cromatina abierta a lo largo de un locus que consiste exclusivamente en genes constitutivos expresados de forma ubicua. Estos elementos no se derivan de una LCR y comprenden islas de CpG sin metilación extendidas. Los inventores han utilizado la expresión elemento de apertura de la cromatina ubicuo (“ubiquitous chromatin opening element”, UCOE) para describir estos elementos.

En el ADN de mamíferos, el dinucleótido CpG es reconocido por una enzima ADN metiltransferasa que metila la citosina a 5-metilcitosina. Sin embargo, la 5-metilcitosina es inestable y se convierte en timina. Como resultado, los dinucleótidos CpG aparecen con mucha menos frecuencia que la esperada por el azar. No obstante, algunas secciones de ADN tienen una frecuencia de CpG más cercana a la esperada, y estas secuencias se conocen como “islas de CpG”. Tal como se emplea en la presente, una “isla de CpG” se define como una secuencia de ADN de al menos 200 pb, que tiene un contenido en GC de al menos 50% y una proporción de contenido en CpG observado/esperado de al menos 0, 6 (es decir, un contenido en dinucleótidos CpG de al menos 60% del esperado por el azar) (Gardiner-Green, M. y Frommer, M., J. Mol. Biol., 196, 261-282 (1987) ; Rice, P., Longden, I. y Bleasby, A., Trends Genet., 16, 276-277 (2000) ) .

Las islas de CpG sin metilación son muy conocidas en la técnica (Bird et al. (1985) , Cell, 40:91-99; Tazi y Bird (1990) , Cell, 60:909-920) y pueden definirse como islas de CpG en las que una proporción sustancial de los restos citosina no están... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido lineal aislado para la integración en un cromosoma, que comprende:

a. una isla de CpG sin metilación extendida,

b. un ácido nucleico expresable terminado con una señal de poliadenilación,

c. un marcador seleccionable unido operablemente a un promotor,

en el que la isla de CpG y el marcador seleccionable están unidos operablemente al ácido nucleico expresable, y los componentes están colocados en el siguiente orden: isla de CpG sin metilación extendida, ácido nucleico expresable, marcador seleccionable, en la orientación 5’ a 3‘ con respecto a la cadena sentido del ácido nucleico expresable, y la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 2000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

2. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 1, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

3. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 2, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 1000 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

4. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 3, en el que la señal de poliadenilación en el extremo 3’ del ácido nucleico expresable está dentro de 500 pb del extremo proximal del marcador seleccionable.

5. Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador seleccionable es un gen de resistencia a un antibiótico.

6. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico se obtiene de una especie de Streptomyces.

7. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un gen de resistencia a puromicina, opcionalmente el gen de puromicina N-acetiltransferasa o un gen de puromicina N-acetiltransferasa modificado de Streptomyces alboniger;

(ii) un gen de resistencia a neomicina, opcionalmente el gen de aminoglicósido fosfotransferasa de Streptomyces fradiae;

(iii) un gen de resistencia a higromicina, opcionalmente el gen de higromicina fosfotransferasa de Streptomyces hygroscopicus;

(iv) un gen de resistencia a bleomicina, opcionalmente la proteína de unión a bleomicina o la bleomicina Nacetiltransferasa de Streptomyces verticillus;

(v) un gen de resistencia a blasticidina, opcionalmente el gen de blasticina S-acetiltransferasa de Streptomyces verticillum.

8. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es la aminociclitol fosfotransferasa de Escherichia coli.

9. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a un antibiótico es el gen de neomicina fosfotransferasa del transposón Tn5.

10. Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen hnRNP A2 humano.

11. Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 8 kb que abarca el gen hnRNP A2 murino.

12. Un polinucleótido lineal aislado según la reivindicación 11, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende los nucleótidos 1-7898 de la secuencia de la figura 19.

13. Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la isla de CpG sin metilación extendida comprende un fragmento de ADN de 2, 0 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de la 1-actina humana y un fragmento de ADN de 1, 8 kb que abarca la región promotora/isla de CpG de PDCD2 humana.

14. Un polinucleótido lineal aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso como

medicamento. 15. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

13.

16. El uso del polinucleótido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para obtener la expresión de un producto génico deseado.

17. El uso del polinucleótido aislado según la reivindicación 16, en el que el producto génico deseado es una proteína terapéutica.