Un procedimiento para maximizar simultáneamente la tasa de duplicación,

la densidad de recolección y lacantidad total de duplicaciones de población para células derivadas de cordón umbilical en un sistema de cultivo defrasco rotatorio que comprende usar una velocidad de rotación de 0,65-0,9 rpm, usando al menos 300 ml de mediode cultivo en un frasco de cultivo de 850 cm2; usar una densidad de siembra de menos de 2500 células porcentímetro cuadrado; e incubar durante entre 5,5 a 6,5 días;

en el que las células que se cultivan se caracterizan porque tienen un perfil de marcador de superficie celularidéntico a las células de partida con respecto a cada uno de: CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLAABC,CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DRDPDQ, y en el que las células son positivas para la expresiónde CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-ABC, pero negativas para la expresión de CD31, CD34,CD45, CD117, CD141 y HLA-DRDPDQ.

Expansión in vitro de células derivadas postparto en frascos rotatorios

Campo de la invención

La presente invención se refiere en líneas generales al cultivo y expansión de células de mamífero. En particular, la 5 presente invención se refiere a procedimientos para el cultivo y expansión in vitro de células derivadas postparto en recipientes tales como frascos rotatorios.

Antecedentes de la invención

Los productos comerciales de terapia celular se producen preferiblemente en sistemas asépticos que están cerrados. Sin embargo, el cultivo de muchas líneas celulares usadas para productos comerciales de terapia celular

es dependiente de anclaje. Aunque los reactores de tanque agitados, los frascos agitadores, frascos de centrifugado, reactores de sustentación, y similares, son todos útiles para células que se cultivan en suspensión (por ejemplo, hibridomas para la producción de anticuerpos monoclonales, muchas células usadas para tecnología de ADN recombinante, y la mayoría de los cultivos de células de insecto) , las opciones para cultivar y expandir células dependientes de anclaje o preferentes de anclaje son más limitadas.

Entre las células dependientes de anclaje se incluyen muchas cepas de células diploides normales, así como la mayoría de las líneas celulares primarias. Las opciones para la producción a gran escala de dichas células incluyen frascos rotatorios, lechos de fibra y sistemas de fibras huecas, sistemas de cultivo multiplaca o de placas apiladas, cubos celulares, y microvehículos, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas.

Los procedimientos basados en frascos rotatorios de cultivo celular son probablemente los procedimientos más

habitualmente usados para cultivar células dependientes de anclaje y preferentes de anclaje. Los frascos rotatorios son esencialmente recipientes cilíndricos, de vidrio o plástico, que están al menos parcialmente cargados con un medio de cultivo. Los frascos rotatorios más modernos están hechos de un material plástico desechable. Los frascos se colocan en un aparato que se gira, causando que los frascos "rueden" continuamente o giren a una velocidad típicamente constante entre aproximadamente 5 y 250 revoluciones por hora. El movimiento rotatorio permite que

las células, que se adhieren a las superficies interiores del frasco, se bañen en el medio mientras se tiene un amplio intercambio de gases con la atmósfera en los frascos.

Los frascos rotatorios están disponibles en varios tamaños, proporcionando cada tamaño una cantidad fija de área superficial y volumen. Muchos frascos están disponibles en el intervalo de volumen de 1-2 litros. Dos frascos rotatorios comerciales de dimensiones habituales proporcionan 850 cm2 y 1050 cm2, respectivamente. Para algunas

aplicaciones, el gran tamaño puede ser una limitación ya que los frascos rotatorios que son demasiados grandes son difíciles de manipular cuando la seguridad microbiológica es crítica. Más recientemente los frascos rotatorios con superficies interiores expandidas han llegado a estar disponibles en el mercado para ayudar a abordar la cuestión. La manipulación de los cultivos en frasco rotatorio, tales como las manipulaciones para el subcultivo, debe minimizarse cuando sea posible.

Los sistemas de cultivo basados en frascos rotatorios proporcionan muchas ventajas incluyendo un coste relativamente bajo para el equipo y la configuración, la facilidad relativa de configuración, y la capacidad de aumentar o disminuir en escala de acuerdo con las necesidades. Los frascos, que típicamente son transparentes, permiten una inspección visual y microscópica de las células y el cultivo. Las muestras contaminadas son fáciles de detectar y pueden desecharse.

Los inconvenientes potenciales incluyen el nivel relativamente elevado de habilidad necesaria para la siembra, transferencias, recolección de las células o productos biológicos producidos, y otra manipulación en curso de las células. Los costes asociados con las operaciones en curso pueden ser elevados a causa del nivel de habilidad requerido. El riesgo de contaminación es relativamente elevado a causa de la cantidad de manipulación requerida. No obstante, a pesar de los inconvenientes potenciales, los frascos rotatorios aun se usan, incluso para la

45 producción comercial de algunos productos biológicos.

Entre los factores que deben considerarse en el uso de frascos rotatorios para el cultivo celular está la eficacia de adherencia, así como el tiempo para alcanzar la confluencia, los parámetros de cultivo de las células adheridas incluyendo la densidad obtenible máxima por área superficial unitaria, las técnicas de desprendimiento; que son necesarias, y la eficacia del desprendimiento, la capacidad de cambiar la escala de las condiciones de cultivo, así

50 como la homogeneidad del cultivo en condiciones aumentadas en escala, y la capacidad de aumentar en escala satisfactoriamente los procedimientos de desprendimiento. Algunas de estas consideraciones pueden verse influidas por los parámetros de inoculación (tales como velocidad de rotación, volumen de medio) , las condiciones de cultivo tales como la velocidad de rotación de los frascos, así como la densidad de siembra del cultivo inicial, el volumen de medio usado con relación al área superficial y/o forma del frasco, y la cantidad de tiempo que se incuba el cultivo.

55 También es importante, particularmente en las aplicaciones terapéuticas celulares, que las características de las células cultivadas en condiciones de frasco rotatorio aumentadas en escala sean aquellas del tipo celular deseado

en términos de marcadores superficiales, expresión génica, viabilidad (más del 70 al 80%) , y similares.

Existe la necesidad de intentar optimizar los parámetros de cultivo controlables para mejorar los sistemas de cultivos en frasco rotatorio en términos de maximizar simultáneamente la tasa de crecimiento, la cantidad de duplicación de la población conseguida, y las células totales disponibles para recoger.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos para maximizar simultáneamente la tasa de duplicación, la densidad de recolección, y la cantidad total de duplicación de la población para células postparto en un sistema de cultivo de frasco rotatorio. Estos procedimientos también se refieren en este documento como optimización del sistema de cultivo de frasco rotatorio para los parámetros anteriores. Los procedimientos preferiblemente comprenden usar una velocidad de rotación de aproximadamente 0, 65-0, 9 rpm, usando al menos aproximadamente 300 ml de medio de cultivo en un frasco de cultivo de 850 cm2; usar una densidad de siembra de menos de aproximadamente 2500 células por centímetro cuadrado; e incubar durante entre aproximadamente 5, 5 a 6, 5 días.

Los procedimientos anteriores son particularmente útiles cuando las células postparto son células derivadas de cordón umbilical, y las células postparto actualmente preferidas son aquellas que son sustancialmente similares, o incluso idénticas a ATCC NOS PTA-6067 y PTA-6068.

Estos y otros aspectos de la invención se describirán con referencia a los ejemplos, figuras, y descripción detallada de los diversos aspectos de la invención que están a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Velocidad de rotación óptima calculada (1, 0 rpm) , volumen de medio (112 ml) , densidad de siembra (2500 células/cm2) , y días en cultivo (6, 27 días) para conseguir la duplicación máxima de población (3, 04) . La línea negra en cada gráfico representa los valores dibujados de los niveles de factor (bajo a elevado a lo largo del eje x) frente a la duplicación de la población (mínimo a máximo a lo largo del eje y) . La línea azul representa el valor máximo único del eje y para los cuatro gráficos. La línea roja representa el punto en el eje x que el valor dibujado de los niveles de factores frente al valor de duplicación de la población (línea negra) intersecta con el valor máximo único del eje y (línea azul) definiendo de este modo el nivel de factor óptimo.

Figura 2: Velocidad de rotación óptima calculada (0, 92 rpm) , volumen de medio (300 ml) , densidad de siembra (2500 células/cm2) , y días en cultivo (5 días) para conseguir... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para maximizar simultáneamente la tasa de duplicación, la densidad de recolección y la cantidad total de duplicaciones de población para células derivadas de cordón umbilical en un sistema de cultivo de frasco rotatorio que comprende usar una velocidad de rotación de 0, 65-0, 9 rpm, usando al menos 300 ml de medio

de cultivo en un frasco de cultivo de 850 cm2; usar una densidad de siembra de menos de 2500 células por centímetro cuadrado; e incubar durante entre 5, 5 a 6, 5 días; en el que las células que se cultivan se caracterizan porque tienen un perfil de marcador de superficie celular idéntico a las células de partida con respecto a cada uno de: CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, HLA-ABC, CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DRDPDQ, y en el que las células son positivas para la expresión

de CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa y HLA-ABC, pero negativas para la expresión de CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 y HLA-DRDPDQ.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células derivadas de cordón umbilical son los números de acceso a la ATCC PTA-6067 y PTA-6068.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la velocidad de rotación es 0, 7 rpm, y el 15 tiempo de incubación es de 6 a 6, 3 días.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la velocidad de rotación es 0, 85 rpm, y el tiempo de incubación es de 6 a 6, 3 días.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un tiempo de duplicación de la

población es de menos de 39 horas, la población alcanza al menos 3 duplicaciones, y la densidad de células en la 20 recolección es de al menos 1, 8 E+4 células/cm2.