ESTRUCTURAS CORNEALES MULTICAPA SINTÉTICAS QUE COMPRENDEN FIBRAS DE COLÁGENO.

Estructuras corneales multicapa sintéticas que comprenden fibras de colágeno. La invención se refiere a un procedimiento para la preparación in vitro de una estructura corneal multicapa sintética que comprende fibras de colágeno, en la que las fibras en cada capa se encuentran orientadas unidireccional y uniformemente, comprendiendo la polimerización sucesiva de capas de una solución formadora de fibras de polímero biológico en presencia de un campo magnético, en la que la orientación de las fibras en por lo menos una capa difiere de la orientación en por lo menos una de las capas superiores y/o inferiores a la misma según un ángulo alfa. Asimismo, la invención se refiere a una estructura corneal multicapa similar a un tejido biológico, que comprende la estructura multicapa sintética y células inoculadas en la misma, tal como una córnea similar a un tejido multicapa ortogonal de colágeno, y al procedimiento para la preparación de la misma. La invención puede utilizarse para prevenir o tratar un tejido dañado, y para crear un modelo para la experimentación biológica, tal como los ensayos de toxicidad farmacológica. El mercado mundial de productos de ingeniería de tejidos se estima en varios cientos de millones de euros. La ingeniería de tejidos está destinada a reparar, sustituir o restaurar la función de los tejidos, típicamente mediante la combinación de materiales biológicos y células vivas. Más particularmente, aproximadamente 10 millones de personas en el mundo sufren de ceguera debida a lesiones o enfermedades de la córnea. El mercado mundial de córneas artificiales se estima en la actualidad en aproximadamente 100.000 unidades al año, incluyendo 25.000 en Europa. Debido a que el precio de venta actual de un implante de córnea artificial es de aproximadamente 2.000 euros, el mercado se estima en aproximadamente 120 millones de euros. La córnea está constituida por tres capas celulares diferentes: el epitelio externo, la estroma central (compuesta de queratocitos en una matriz extracelular densa y muy organizada de fibrillas de colágeno y proteoglicanos) y el endotelio interno. La estroma se encuentra delimitada por estructuras acelulares especializadas, las membranas de Bowman y de Descemet, que se encuentran en la interfaz entre el epitelio y el endotelio, respectivamente (ver la figura 7). La estroma constituye aproximadamente 90% del volumen corneal y 70% del peso seco de la córnea. Durante la embriogénesis, se forma una etroma primaria acelular muy estructurada que se cree que determina el patrón de organización de la estroma adulta (Trelstad y Coulombre, 1971a). Dentro de la estroma adulta, las fibrillas de colágeno, compuestas de los colágenos de tipos I y V, presentan un diámetro uniformemente estrecho (30 nm) y se encuentran dispuestas en lamelas, en las que las fibrillas se disponen en paralelo y se encuentran separadas por una matriz rica en proteoglicanos. Las fibrillas de colágeno son estabilizadas por enlaces cruzados covalentes intramoleculares e intermoleculares, que proporcionan resistencia ténsil y estabilizan las fibrillas frente a la degradación proteolítica. Se cree que la transparencia depende en gran medida de la arquitectura tridimensional ordenada de las fibrillas delgadas de colágeno. Los estudios de microscopía electrónica (Trelstad y Coulombre, 1971c) y de difracción de rayos X (Meek et al., 1987) indican que las fibrillas en lamelas estromales contiguas son predominantemente ortogonales. El entrelazado de las lamelas estromales dota a la córnea de propiedades biomecánicas altamente no lineales, rigidificándose crecientemente al someterla a una presión intraocular elevada, lo que permite a la córnea sobrevivir a influencias anormales, tales como impactos, daños y cirugía, sin que estalle. La construcción de un andamiaje que reproduzca estrechamente la arquitectura nativa de la estroma, incluyendo lamelas ortogonales que constan de fibrillas de colágeno alineadas, sería una baza importante en el desarrollo de implantes corneales biodiseñados. En vista de la escasez de donantes a nivel mundial, el creciente riesgo de enfermedades infecciosas, la utilización generalizada de cirugía correctora que inutiliza las córneas para el injerto, y las graves limitaciones de las córneas artificiales sintéticas basadas en polímero disponibles (queratoprótesis), existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Además de sus potenciales usos clínicos como miméticos tridimensionales de tejidos, las córneas de ingeniería tisular deberían facilitar el estudio in vitro de la compleja fisiología del tejido vivo y resultarían asimismo alternativas a los modelos animales de experimentación de la toxicidad farmacológica (Germain et al., 1999; Griffith et al., 1999; Builles et al., 2007). Aunque los dos modelos corneales humanos in vitro comercializados en la actualidad para este último propósito, de SkinEthic Laboratories (Nice, Francia) y de MatTek Corporation (EpiOcular TM ; Ashland, MA, USA), proporcionan un epitelio similar a la córnea, los componentes clave estromal y endotelial se encuentran totalmente ausentes. La validez del ensayo de toxicidad únicamente puede mejorarse introduciendo modelos más completos más similares a la córnea humana normal, tanto en composición como en organización. Los últimos avances en ingeniería tisular, tecnología de células madre y nanoingeniería han sido utilizados con éxito para reparar córneas humanas e incluso para recrear un tejido similar a la córnea humana de novo. Los injertos de láminas epiteliales del limbo de la córnea, cultivados en fibrina, han demostrado eficacia clínica a largo plazo en la regeneración de la superficie corneal dañada (Rama et al., 2001; Pellegrini et al., 1997). El tejido ocular dañado 2 E07820364 02-12-2011   también ha sido restaurado utilizando células epiteliales cultivadas sobre membranas amnióticas (Tsai et al., 2000; Schwab et al., 2000) y sobre superficies de cultivo celular sensibles a la temperatura (Nishida et al., 2004). También se han desarrollado matrices acelulares aisladas que presentan algunas propiedades de tipo estromal y que proporcionan soporte a la penetración celular y a la regeneración tisular tras su implantación, con algunos resultados alentadores (Li et al., 2005; Liu et al., 2006). Este último enfoque supone proporcionar un andamiaje optimizado que facilita la colonización celular y el remodelado tisular tras la implantación. Si prospera, esta estrategia presentaría la virtud de resultar más fácil y económica de implementar en un contexto clínico que otras soluciones más complejas. Sin embargo, todas las matrices biológicas creadas hasta el momento carecen por completo de la muy organizada arquitectura tridimensional basada en el colágeno presente en la estroma nativa. El colágeno ha sido alineado con éxito utilizando varias técnicas. El flujo electrohidrodinámico o el electrohilado pueden generar láminas colágenas orientadas. La primera técnica da lugar a cintas ultrafinas de fibrillas de diámetro pequeño (~3 nm) muy orientadas (Jian et al., 2004), mientras que el electrohilado resulta en fibras más gruesas menos bien orientadas de diámetro variable (Boland et al., 2004; Matthews et al., 2002). Sin embargo, no se ha demostrado que ninguna de estas técnicas pueda dar lugar a nada más que a materiales alineados unidireccionalmente. Otro enfoque aprovecha la ordenación cristalina líquida espontánea que tiene lugar con el tiempo en las soluciones de colágeno a elevada concentración. Se forma una fase colestérica en la que las moléculas se alinean en planos que giran continuamente de un modo helicoidal. Se forman matrices ordenadas tridimensionalmente mediante la inducción de fibrilogénesis (Besseau et al., 2002; Mosser et al., 2006). La colonización de estas matrices densas de colágeno (40 mg/ml) por fibroblastos dérmicos humanos hasta una profundidad de 400 µm en un mes demuestran que presentan potenciales aplicaciones de ingeniería tisular. El colágeno altamente orientado (Torbet y Ronziere, 1984; Murthy, 1984) se produce al transformar una solución de moléculas en un gel en un campo magnético fuerte debido al efecto acumulado de la multitud de moléculas anisotrópicas débilmente diamagnéticas (Worcester, 1978). Muchos tipos celulares, entre ellos fibroblastos (Guido y Tranquillo, 1993), queratinocitos, osteoblastos (Kotani et al., 2000), neuritas (Dubey et al., 1999) y células endoteliales que experimentan angiogénesis (Torbet et al., 2000), se alinean mediante guiado por contacto al sembrarse en estos sustratos de colágeno o fibrina orientados magnéticamente. Se han propuesto dos aplicaciones de ingeniería tisular basadas en la orientación magnética de estos polímeros biológicos: tubos huecos que presentan una pared exterior de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación in vitro de una estructura corneal multicapa sintética que comprende fibras de colágeno, en el que dichas fibras en cada capa se encuentran orientadas unidireccional y uniformemente, que comprende las etapas siguientes: a) colocar un soporte que contiene una capa de una solución formadora de fibras de colágeno en un campo magnético e inducir la formación de fibras mediante la neutralización y el calentamiento de la solución formadora de fibras de colágeno, con el fin de obtener unas fibras que se encuentran orientadas unidireccional y uniformemente en la capa, en el que la neutralización de la solución se lleva a cabo previamente a la etapa de calentamiento, permitiendo así introducir la solución formadora de fibras de colágeno neutralizada en el soporte para formar una capa, y la etapa de calentamiento se lleva a cabo en presencia del campo magnético, con el fin de obtener unas fibras que se encuentran orientadas unidireccionalmente en la capa, b) introducir una capa adicional de la solución formadora de fibras de colágeno en el soporte, siendo dicha capa adicional introducida sobre la capa obtenida en la etapa a), c) colocar el soporte en el campo magnético e inducir la formación de fibras mediante la neutralización y el calentamiento de la solución formadora de fibras de colágeno, con el fin de obtener fibras que se encuentran orientadas unidireccional y uniformemente en dicha capa adicional, en el que la neutralización de la solución se lleva a cabo previamente a la etapa de calentamiento, permitiendo así introducir la solución formadora de fibras de colágeno neutralizada en el soporte para formar una capa, y la etapa de calentamiento se lleva a cabo en presencia del campo magnético, con el fin de obtener unas fibras que se encuentran orientadas unidireccionalmente en la capa, d) opcionalmente, repetir las etapas anteriores, obteniendo así una estructura corneal multicapa sintética, en el que la orientación de las fibras en por lo menos una capa difiere de aquella en por lo menos una de su capa superior y/o inferior según un ángulo alfa, y en el que dicha orientación diferencial resulta de cambiar mediante una rotación según el ángulo alfa la posición del soporte de la etapa c) respecto a la posición del soporte de la etapa a). 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la orientación de las fibras en cada capa difiere de aquella en por lo menos una de su capa superior y/o inferior según el ángulo alfa. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la estructura corneal multicapa sintética comprende además proteoglicanos. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la estructura corneal multicapa sintética comprende además unos enlaces cruzados covalentes obtenidos utilizando compuestos químicos tales como hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) o éster de N-hidroxisuccinimida (NHS). 5. Procedimiento según cualquiera de las rievindicaciones 1 a 4, en el que la estructura corneal multicapa sintética comprende además unos enlaces cruzados covalentes obtenidos utilizando enzimas tales como la transglutaminasa o la lisilo oxidasa. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la estructura corneal multicapa sintética se deshidrata mediante evaporación o transferencia utilizando un soporte semipermeable. 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la estructura corneal multicapa sintética se liofiliza. 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ángulo alfa es de 90º, obteniendo así una estructura corneal multicapa ortogonal sintética. 9. Estructura corneal multicapa sintética que comprende fibras de colágeno, en el que dichas fibras en cada capa se encuentran orientadas unidireccional y uniformemente y en la que la orientación de las fibras en por lo menos una capa difiere de aquella en por lo menos una de su capa superior y/o inferior según un ángulo alfa, pudiéndose obtener dicha estructura mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8. 13 E07820364 02-12-2011   10. Procedimiento para la preparación in vitro de una córnea similar a un tejido multicapa de colágeno, que comprende la preparación de una estructura corneal multicapa sintética de acuerdo con el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y la inoculación de las células en la misma. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha córnea similar a un tejido multicapa de colágeno es la estroma corneal, la hemicórnea o la córnea completa. 12. Procedimiento según la reivindicación 10 ó 11, en el que las células son queratocitos, células endoteliales, células epiteliales o una combinación de las mismas. 13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la inoculación de células se lleva a cabo mediante la adición de las células a la solución formadora de fibras de colágeno neutralizada y/o añadiendo las células a la córnea similar a un tejido multicapa de colágeno. 14. Córnea similar a un tejido multicapa de colágeno que comprende la estructura corneal multicapa sintética según la reivindicación 9 y las células inoculadas en la misma. 15. Córnea similar a un tejido multicapa de colágeno según la reivindicación 14, que es una córnea similar a un tejido multicapa ortogonal de colágeno, tal como una estroma corneal, una hemicórnea o una córnea completa. 16. Córnea similar a un tejido multicapa de colágeno según la reivindicación 15, en la que las células son queratocitos, células endoteliales, células epiteliales o una combinación de las mismas. 17. Utilización de la estructura corneal multicapa sintética según la reivindicación 9, para la preparación de una córnea similar a un tejido multicapa de colágeno. 18. Córnea similar a un tejido multicapa de colágeno según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, para su utilización como medicamento. 19. Utilización de la córnea similar a un tejido multicapa de colágeno según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, como modelo para la experimentación biológica, tal como la experimentación de la toxicidad farmacológica. 20. Utilización de la córnea similar a un tejido multicapa ortogonal de colágeno según la reivindicación 15 ó 16, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de un tejido corneal dañado en un sujeto, tal como la estroma corneal, la hemicórnea, la córnea completa o una combinación de las mismas. 14 E07820364 02-12-2011   E07820364 02-12-2011   16 E07820364 02-12-2011   17 E07820364 02-12-2011   18 E07820364 02-12-2011