Equivalente de piel envejecida, su procedimiento de obtención y su utilización.

Equivalente de dermis de edad, que comprende al menos colágeno glicado y fibroblastos,

caracterizado por el hecho de que presenta una tasa de glicación comprendida entre 2 y 30.

Equivalente de piel envejecida, su procedimiento de obtención y su utilización.

La presente invención se refiere a un nuevo equivalente de piel envejecida, a su procedimiento de obtención así como al equivalente de epidermis y al equivalente de dermis envejecida, comprendidas en este equivalente de piel envejecida y a sus utilizaciones in vitro.

Se investiga para poner a punto, desde hace varios años, modelos de piel reconstituida que permitan efectuar los estudios necesarios para la mejor comprensión del papel de la piel tanto en el campo mecánico como en el campo fisiológico.

Así, se han podido poner a punto modelos más o menos próximos a la piel humana. Se pueden citar, por ejemplo, los modelos descritos en las solicitudes de patentes EP-A-285471, EP-A-285474, EP-A-789074, EP-A-502172, EPA-418035, WO-A-9116010, EP-A-197090, EP-A-20753, FR-A-2665175, FR-A-2689904. Algunos estudios se han basado igualmente en la evaluación del poder alérgeno de los constituyentes de un equivalente de piel humana (Nemecek G y col., Toxicology Pathology, vol. 27, nº 1, Enero de 1999, páginas 101-103) , sobre la recolonización por células de Langerhans de un equivalente de piel injertada sobre un ratón (Demarchez M y col., Journal of Investigative Dermatology, vol. 100, nº 5, 1993, páginas 648-652) y sobre la expresión diferencial de marcadores de diferenciación como las integrinas en las capas suprabasales de la epidermis a partir de un equivalente de epidermis (Font y col., Cell Biology and toxicology, vol. 10, nº 5-6, 1994, páginas 353-359) o de un equivalente de piel humana sometido a una radiación UV (Hendéis S. W y col., Archives of Dermatological Research, vol. 290, nº 8, 1998, páginas 420-424) . De manera muy general, los modelos de piel reconstituida descritos en estos documentos comprenden queratinocitos humanos asociados o no a otras células de la piel como los melanocitos y/o las células de Langerhans, depositados sobre un soporte, a menudo un equivalente de dermis, y cultivados en condiciones tales que entran en un programa de diferenciación que desemboca en la formación de un equivalente de epidermis.

Los equivalentes de dermis descritos actualmente o bien son membranas artificiales como por ejemplo los filtros de la marca Millipore, sustitutos subcutáneos a base de colágeno, de plástico o de cualquier otro soporte compatible con la viabilidad celular, o bien soportes más elaborados para hacerlos más próximos a la dermis natural, como la dermis previamente desepidermizada o látex mixtos de colágeno/fibroblastos.

En los látex mixtos de colágeno/fibroblastos, la asociación de colágeno nativo y de fibroblastos humanos aislados conduce a la obtención de un equivalente de dermis que imita una dermis que no ha sido sometida a la acción del tiempo.

Los protocolos utilizados para la preparación de dichos látex utilizan colágeno que procede, en general, de tejidos jóvenes, colágeno que ha experimentado, sin embargo, las importantes modificaciones post-traducción que intervienen en los procesos complejos, pero a pesar de todo normales de su biosíntesis, pero que no ha experimentado todas las modificaciones que pueden intervenir particularmente en el curso del envejecimiento.

Se conoce, en particular, que en el curso del envejecimiento, así como en el curso de ciertas enfermedades, tales como la diabetes, se producen procesos no enzimáticos que hacen intervenir a una osa (glucosa o ribosa) que reacciona según la reacción de Maillard con un grupo aminado (por ejemplo, un resto de lisina) del colágeno paraformar una base de Schiff. Ésta, después de la re-disposición molecular llamada de Amadori, puede conducir, por una sucesión de reacciones, a una construcción de un puente intermolecular como por ejemplo del tipo pentosidina. Este fenómeno, denominado glicación del colágeno, aumenta de forma regular con la edad lo que implica un aumento regular del contenido de la piel en productos de glicación. Estos productos de glicación son, por ejemplo, la pirralina, la carboximetil-lisina, la pentosidina, la crosslines, la N£ (2-carboxietil) -lisina (CEL) , la glioxal-lisina dímero (GOLD) , la metilglioxal-lisina dímero (MOLD) , la 3DG-ARG imidazolona, las versperlisinas A, B, C, la treosidina o incluso los productos finales de glicosilación avanzada (Productos finales de glicosilación avanzada o AGEs) . Reiser M y col. (Journal of Biochemistr y , vol. 267, nº 4, 1992, páginas 24207-24216) ha puesto principalmente en evidencia la presencia de sitios preferenciales de glicación sobre las cadenas de colágeno, conservadas en el curso del envejecimiento.

Este fenómeno es amplificado en ciertas enfermedades como, por ejemplo, la diabetes.

Sin querer introducir ninguna teoría del envejecimiento de la piel, hay que indicar que otras características, que podrían ser igualmente una consecuencia de estos fenómenos de glicación como una disminución de la desnaturalización por calor, un aumento de la resistencia a la digestión enzimática y un aumento de las construcciones de puentes intermoleculares, han podido ser puestas en evidencia en el curso del envejecimiento de la piel (Tanaka S. y col. 1988, J. Mol. Biol. 203, 495-505; Takahashi M. y col. 1995, Analytical Biochemistr y , 232, 158-162) . Además, modificaciones debidas a la glicación de ciertos constituyentes de la membrana basal como el colágeno IV, la laminina y la fibronectina han podido ser puestas en evidencia (Tarsio JF. y col., 1985, Diabetes, 34, 477-484; Tarsio JF. y col., Diabetes, 37, 532.539; Stemberg M. y col., 1995, C. R. Soc. Biol., 1989, 967-985) .

Así se comprende que en el curso del envejecimiento de la piel, las propiedades físico-químicas del colágeno se modifican y éste llega a ser más difícilmente soluble y más difícilmente degradable. Así, uno de los componentes de la piel envejecida parece ser el colágeno glicado.

Se conoce bien que la piel resulta de una estrecha asociación entre al menos dos compartimientos que la constituyen, a saber, la epidermis y la dermis. Las interacciones entre la dermis y la epidermis son tales que es razonable pensar que una modificación de una puede tener consecuencias sobre la otra. Se puede sospechar que el envejecimiento de la dermis en particular con sus fenómenos de glicación no puede tener más que consecuencias sobre la epidermis que la está asociada. Así en el curso del envejecimiento cutáneo, la glicación del colágeno debe implicar modificaciones de la epidermis que participan necesariamente en el envejecimiento de la epidermis.

A este respecto, la Firma Solicitante ha podido mostrar ahora que una proteína constitutiva de la epidermis normal, a saber, la integrina del tipo 11, receptor de la matriz extracelular (ver Rouslahti E., 1991, Cell biology of extracellular Matrix, Plenum press Nueva York, 343363) , presenta en la epidermis envejecida una distribución de su expresión muy diferente de la que existe en una epidermis joven. En efecto, si en una epidermis joven, es decir, en el sentido de la Firma Solicitante, una epidermis de sujeto joven, esta proteína se expresa en las capas muy inferiores de la epidermis, a saber, como máximo hasta la segunda capa suprabasal, todo lo contrario sucede en una epidermis envejecida, es decir, en el sentido de la Firma Solicitante, en una epidermis de sujeto viejo, donde esta proteína se expresa en la mayor parte de las capas de la epidermis, hasta las últimas capas suprabasales, debajo de la capa córnea.

Actualmente, ningún modelo de piel reconstituida in vitro es capaz, ya sea a causa de los protocolos de preparación utilizados, ya sea debido al simple hecho de que una vez reconstituida no experimenta ninguna modificación, de producir un equivalente de piel, al menos uno de cuyos constituyentes presenta uno de los componentes del envejecimiento cutáneo. Así, ningún modelo de piel reconstituida in vitro presenta las características de una piel envejecida y no permite el estudio de los procesos que conducen a ello, ni el estudio de los compuestos y/o composiciones que permitan al menos ralentizar este / estos procesos. Las únicas evaluaciones de estos fenómenos pasan por estudios in vitro, ya sea en el animal o en el hombre. Muy particularmente, por razones de ética, se comprende el interés en disponer de un modelo de este tipo.

Se conocen estudios sobre la glicación en la técnica anterior. Por ejemplo, se describe un procedimiento para obtener un equivalente de tejido conjuntivo en forma de un látex de colágeno glicado y de fibroblastos (ver a este respecto Frey y col., (1992, C. R. Soc. Biol.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de preparación de un equivalente de piel envejecida, que comprende un equivalente de epidermis y un equivalente de dermis envejecida, que comprende un látex que comprende al menos colágeno glicado y fibroblastos, caracterizado por el hecho de que en una primera etapa se prepara un látex que comprende al menos colágeno glicado y fibroblastos, siendo glicado dicho colágeno previamente a la formación del látex, y por el hecho de que en una segunda etapa se reconstituye sobre el látex obtenido en la primera etapa un equivalente de epidermis que comprende al menos queratinocitos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la glicación se obtiene por la puesta en presencia de una solución de al menos un colágeno y de una solución de al menos un agente de glicación con el fin de inducir la reacción de glicación in vitro en ausencia de células.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por el hecho de que el colágeno es colágeno de origen humano o animal.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que el colágeno es colágeno de origen animal.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que el colágeno es colágeno de origen bovino.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el colágeno está elegido entre los colágenos de tipo I, III o V.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que el colágeno es colágeno de tipo I.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que el colágeno es colágeno bovino de tipo I.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que el colágeno está en una concentración comprendida entre 2 mg/ml y 6 mg/ml y con preferencia entre 3 mg/ml y 5 mg/ml.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que el agente de glicación es un agente que permite la glicación, es decir, que es capaz de reaccionar según la reacción de Maillard con un grupo aminado del colágeno para formar una base de Schiff.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que el agente de glicación está elegido entre la glucosona, la 3-deoxiglucosona, el glioxal, el metil-glioxal o incluso los azúcares.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado por el hecho de que el agente de glicación es un azúcar.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que el azúcar está elegido entre las osas.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por el hecho de que la osa esté elegida entre la ribosa, la fructosa o la glucosa.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por el hecho de que el agente de glicación está elegido entre la ribosa o la glucosa.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por el hecho de que la cantidad de agente de glicación está comprendida entre 0, 5 % y 20 %, de una manera preferida entre 1 % y 10 % en peso del peso total de la solución de colágeno.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones, 1 a 16 caracterizado por el hecho de que la reacción de glicación se realiza a una temperatura comprendida entre 15ºC y 30ºC, con preferencia entre 20ºC y 25ºC.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado por el hecho de que la duración de la reacción de glicación está comprendida entre 15 días y 2 meses, con preferencia entre 25 y 35 días.

19. Procedimiento según la reivindicación 1 a 18, caracterizado por el hecho de que la relación entre el colágeno glicado y el colágeno no glicado está comprendida entre 25 y 75 y con preferencia entre 45 y 55.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por el hecho de que los queratinocitos utilizados según la invención son de origen humano.

21. Equivalente de dermis envejecida, que puede ser obtenido por el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 20 que comprende al menos colágeno glicado y fibroblastos, caracterizado por el hecho de que presenta una tasa de glicación comprendida entre 2 y 30.

22. Equivalente de dermis envejecida según la reivindicación 21, caracterizado por el hecho de que presenta una tasa de glicación comprendida entre 8 y 18.

23. Equivalente de dermis envejecida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, caracterizado por el hecho de que el colágeno glicado es de origen animal o humano.

24. Equivalente de dermis envejecida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado por el hecho de que el colágeno glicado es de origen animal.

25. Equivalente de dermis envejecida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado por el hecho de que el colágeno glicado es de origen bovino.

26. Equivalente de dermis envejecida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado por el hecho de que el colágeno glicado es colágeno del tipo I.

27. Equivalente de dermis envejecida según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado por el hecho de que los fibroblastos son de origen humano.

28. Equivalente de epidermis que comprende al menos queratinocitos, caracterizado por el hecho de que puede ser obtenido por simiente de al menos queratinocitos sobre un equivalente de dermis, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, y por el hecho de que presenta una expresión de interina 11 en las células de al menos las tres primeras capas suprabasales.

29. Equivalente de dermis envejecida según la reivindicación 28, caracterizado por el hecho de que los queratinocitos son de origen humano.

30. Equivalente de dermis envejecida según una cualquiera de las reivindicaciones28 a 29, caracterizado por el hecho de que comprende, además, melanocitos y/o células de Langerhans y/o precursores de células de Langerhans.

31. Equivalente de piel envejecida, caracterizado por el hecho de que comprende al menos un equivalente de epidermis y un equivalente de dermis envejecida, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27.

32. Equivalente de piel envejecida, según la reivindicación 31, caracterizado por el hecho de que comprende un equivalente de epidermis, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30.

33. Utilización in vitro de un equivalente de dermis envejecida tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, para la preparación de equivalente de epidermis y/o de piel envejecida.

34. Utilización in vitro de un equivalente de dermis envejecida, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, para el estudio del fenómeno de glicación en sí mismo así como de los moduladores (inhibidores o activadores) de este fenómeno, el estudio del foto-envejecimiento y del efecto de las radiaciones ultravioletas sobre la dermis así como de los moduladores de estos efectos (compuestos y/o composiciones de protecciones, filtros, etc.) o el estudio de la influencia de la glicación sobre los componentes de la dermis.

35. Utilización in vitro de un equivalente de dermis envejecida, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, para el estudio del fenómeno de glicación en sí mismo así como de los moduladores (inhibidores o activadores) de este fenómeno, el estudio de los fenómenos ligados a la epidermis envejecida como por ejemplo de las arrugas, el estudio de los moduladores (compuestos aislados y/o composiciones) de la aparición de las arrugas (inhibidores particularmente) , el estudio del fotoenvejecimiento y del efecto de las radiaciones ultravioletas sobre la epidermis así como de los moduladores de estos efectos (compuestos y/o composiciones de protecciones, filtros, etc.) , el estudio de la influencia de la glicación sobre los componentes de la epidermis y los anexos de la piel.

36. Utilización in vitro de un equivalente de piel envejecida, tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 31 o 32, para el estudio del fenómeno de glicación en sí mismo así como de los moduladores (inhibidores o activadores) de este fenómeno, el estudio de los fenómenos ligados a la piel envejecida y/o la epidermis envejecida como por ejemplo de las arrugas, el estudio de los moduladores (compuestos aislados y/o 5 composiciones) de la aparición de las arrugas (inhibidores particularmente) , el estudio del fotoenvejecimiento y del efecto de las radiaciones ultravioletas sobre la piel y/o la epidermis así como de los moduladores de estos efectos (compuestos y/o composiciones de protecciones, filtros, etc.) , el estudio de la influencia de la glicación sobre los componentes de la epidermis y los anexos de la piel y/o de la dermis y/o de la epidermis (pelos y/o cabellos, vasos sanguíneos, fibras nerviosas, etc.) y en el campo terapéutico el estudio de las complicaciones causadas por la diabetes a través de la glicación.