Un método para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptídicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptídicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina acetilada; poner en contacto el conjunto de sustratos peptídicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptídicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y

determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptídicos;

en el que una reducción del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptídicos es indicativa de actividad desacetilasa.

Ensayos de polarización de fluorescencia para la actividad acetiltransferasa/desacetilasa ANTECEDENTESº

La acetilación y desacetilación de proteinas histonas, factores de transcripción y proteinas relacionadas desempenan un papel importante en el control de los procesos celulares. En particular, el estado de acetilación de las histonas controla lo estrechamente que las proteinas histonas interaccionan con el ADN, y por lo tanto lo accesible que es el ADN a los factores de transcripción. Las enzimas que anaden grupos acetilo a histonas u otras proteinas se denominan histona acetiltransferasas (HAT) . Las enzimas que eliminan los grupos acetilo entran en dos familias: las histona desacetilasas (HDAC) y la familia de desacetilasas de Sir2. Actualmente, hay 11 miembros conocidos de la familia de HDAC de mamiferos (Gray y Ekstrom, Exper. Cell Res. 2001, 262, 75-83; Zhou, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 10572-10577; Kao et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 187-193; Gao et al. J. Biol. Chem. 2002, 277, 25748-25755) y 7 miembros de la familia de Sir2 (Gray y Ekstrom, Exper. Cell Res. 2001, 262, 7583) .

Las histona acetiltransferasas catalizan la transferencia de un grupo acetilo desde la acetil-CoA al grupo ε-amino de un residuo de lisina en la proteina diana. Se han caracterizado muchas enzimas HAT a partir de organismos eucarióticos (Sterner y Berger, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000, 64, 435-459) . Las enzimas HDAC utilizan un ión de cinc en el sitio activo de la proteina para catalizar la eliminación del grupo acetilo de la acetil-lisina en forma de acetato. Los miembros de la familia de Sir2 de enzimas usan NAD como cofactor en la hidr6lisis de acetil-lisina.

El estado de acetilación de las proteinas histonas desempena un papel importante en la expresión genica y el control del ciclo celular y parece desempenar un papel en ciertas formas de cancer. En particular, se ha mostrado que el agrupamiento anormal de histona desacetilasas por proteinas correpresoras promueve el desarrollo de leucemia promielocitica. En estirpes celulares tumorales, varios estudios han mostrado que el tratamiento con inhibidores de HDAC puede conducir a la inhibición del crecimiento, detención del crecimiento, diferenciación terminal y/o apoptosis. Los estudios in vivo han demostrado inhibición del crecimiento de tumores y reducción de la metastasis tumoral como resultado del tratamiento con inhibidores de HDAC (Kramer et al. Trends Endocrinol. Metab. 2001, 12, 294-300) .

El estudio eficaz de la enzimologia y modulación de enzimas HAT, HDAC y Sir2 depende de la disponibilidad de ensayos robustos que puedan efectuarse en formato de alto rendimiento. Se han desarrollado varias metodologias de ensayo para estas enzimas, con grados variables de utilidad para el cribado de inhibidores y activadores.

Los ensayos de histona acetiltransferasa estan tipicamente basados en la radiactividad. En estos formatos, se hace reaccionar acetil-CoA radiomarcada en el grupo acetilo con el peptido correspondiente a una secuencia aminoacidica de histona. Se cuantifica la transferencia del acetato radiomarcado al peptido mediante la unión del peptido a resina de afinidad (Ait-Si-Ali et al. Nucleic Acids Res. 1998, 26, 3869-3870) , papel de fosfocelulosa (Tanner et al. J. Biol. Chem. 1999, 274, 18157-18160) o microplacas de centelleo (Wynne Aheme et al. Methods 2002, 26, 245-53) y la medida de la radiactividad asociada. En un formato de ensayo acoplado no radiactivo, la CoA libre formada en la reacción de acetiltransferasa sirve como sustrato para la a-cetoglutarato deshidrogenasa o la piruvato deshidrogenasa. La formación de NADH sirve como medida de la tasa de actividad acetiltransferasa (Kim et al. Anal. Biochem. 2000, 280, 308-314) .

La metodologia de ensayo de desacetilasa mas comun implica el marcaje de grupos de lisina en peptidos de histona con acetato radiomarcado. La enzima desacetilasa elimina el grupo acetilo como acetato, que se aisla posteriormente mediante extracción y se cuantifica basandose en su radiactividad (Inoue y Fujimoto, Biochim. Biophys. Acta 1970, 220, 307-316) . En una variante de este enfoque, el ensayo de centelleo por proximidad, los peptidos derivatizados con grupos acetilo radiomarcados se unen a una perla que contiene agente de centelleo que emite luz tras exposición a radiación. En este formato de ensayo, la escisión de los grupos acetilo causa una 45 reducción de la emisión de luz por el agente de centelleo (Nare, et al., Anal. Biochem. 1999, 267, 390-396) . Un ensayo no basado en radiactividad usa peptidos que contienen un grupo acetil-lisina y un marcador fluorescente. La reactividad se mide mediante cromatografia liquida de alta resolución, usando la diferencia en el tiempo de retención de los peptidos acetilado y no acetilado para aislar y cuantificar los productos de reacción (Hoffmann et al. Nucleic Acids Res. 1999, 27, 2057-8; Hoffmann et al. Bioconjug Chem. 2001, 12, 51-5; Hoffmann et al. Arch Pharm

50 (Weinheim) 2001, 334, 248-52) . Un ensayo comercial usa un protocolo de detección de dos etapas. En la primera etapa, se hace reaccionar un peptido que contiene acetil-lisina con una desacetilasa durante un periodo dado de tiempo. Despues de ello, se inactiva la reacción, se hace reaccionar la lisina expuesta con un agente de revelado que produce un fluoróforo y se cuantifica la cantidad de lisina desacetilada usando la fluorescencia del producto (Biomol, Plymouth Meeting, Pa., EE.UU.) . Mas recientemente, se ha notificado un ensayo de dos etapas acoplado 55 con proteasa en el que se disen6 un peptido que contenia un par donante/inactivador de transferencia de energia por resonancia de fluorescencia (FRET) y una acetil-lisina. Despues de dejar transcurrir la reacción de desacetilasa, se inactiva la reacción y se cuantifica la cantidad de peptido desacetilado mediante reacción del peptido desacetilado con una enzima proteasa que escinde especificamente despues de residuos de lisina (Frey et al., presentado en la 224a reunión nacional de la American Chemical Society, Boston, Mass., agosto de 2002; articulo MEDI-121,

Marcotte et al., Anal. Biochem., 332: 90 (2004) ) . Hasta la fecha, no se han notificado ensayos de histona desacetilasa no radiactivos continuos.

El documento W00214543 da a conocer un metodo de ensayo de la actividad desacetilasa/acetilasa usando un sustrato marcado con un fluoróforo y al menos un residuo de lisina acetilada. El sustrato se incuba con la acetilasa o desacetilasa. La actividad enzimatica se detecta posteriormente, lo que puede efectuarse en un inmunoensayo de fluorescencia tal como un inmunoensayo de polarización de fluorescencia.

Wegener y colaboradores (Analytical Biochemistr y , 2003, vol. 321, paginas 202-208) describen sustratos peptidicos fluorogenicos especificos de HDAC (histona desacetilasa) que comprenden un resto de lisina acetilada y un resto de 4-metilcumarin-7-amida adyacente en el extremo C de la cadena peptidica para uso en un ensayo de HDAC. Tras la desacetilación del resto lisilo, se reconocen las moleculas como sustratos de tripsina, que libera moleculas altamente fluorescentes para medir.

Marcotte y colaboradores (Analytical Biochemistr y , 2004, vol. 332, paginas 90-99) describen un sustrato peptidico de desacetilasa que comprende un fluoróforo (6-TAMRA) , al menos un residuo de lisina acetilada y QSY-7 como grupo inactivador no fluorescente. El peptido desacetilado se escinde facilmente por tripsina, dando como resultado una potenciación de la fluorescencia de 6-TAMRA

Los rasgos de los formatos de ensayo anteriores limitan su utilidad. Los ensayos basados en radiactividad tienden a ser costosos, y requieren precauciones de manejo especiales. Tambien son a menudo dificiles de efectuar en un formato de alto rendimiento. Por consiguiente, son necesarios ensayos mejorados para medir la actividad de acetiltransferasas o desacetilasas.

SUMARIO

Se proporcionan en la presente memoria metodos para determinar la actividad de enzimas que modulan la acetilación de un sustrato proteico, incluyendo acetiltransferasas y desacetilasas. Se proporcionan tambien metodos para identificar compuestos que modulan la actividad de una acetiltransferasa o desacetilasa.

En un aspecto, la invención proporciona un metodo para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende: (a) poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina acetilada; (b) poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para determinar la actividad de una desacetilasa que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina acetilada; poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos; en el que una reducción del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativa de actividad desacetilasa.

2. Un metodo para identificar un compuesto que modula una desacetilasa que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una desacetilasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina acetilada;

poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;

en el que un cambio en el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparación con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad desacetilasa.

3. El metodo de la reivindicación 1 o 2, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un grupo voluminoso y dicho al menos un residuo de lisina acetilada esta localizado entre el fluoróforo y el grupo voluminoso.

4. El metodo de la reivindicación 3, en el que dicho grupo voluminoso es biotina, un complejo de biotinaavidina o un complejo de biotina-estreptavidina.

5. El metodo de la reivindicación 1 o 2, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un sitio de unión y dicho al menos un residuo de lisina acetilada esta localizado entre el fluoróforo y el sitio de unión.

6. Un metodo para determinar la actividad de una acetiltransferasa que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una acetiltransferasa, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina; poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos, en el que un aumento del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de actividad acetiltransferasa.

7. Un metodo para identificar un compuesto que modula una acetiltransferasa que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una acetiltransferasa en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina localizado entre el fluoróforo y el sitio de unión;

poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;

en el que un cambio del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparación con un control, es indicativo de un compuesto que modula la actividad acetiltransferasa.

8. El metodo de la reivindicación 6 o 7, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un grupo voluminoso y dicho residuo de lisina esta localizado entre el fluoróforo y el grupo voluminoso.

9. El metodo de la reivindicación 8, en el que dicho grupo voluminoso es biotina, un complejo de biotinaavidina o un complejo de biotina-estreptavidina.

10. El metodo de la reivindicación 6 o 7, en el que los miembros del conjunto de sustratos peptidicos comprenden adicionalmente un sitio de unión y dicho al menos un residuo de lisina esta localizado entre el fluoróforo y el sitio de unión.

11. El metodo de la reivindicación 5 o 10, en el que dicho metodo comprende adicionalmente el conjunto de sustratos peptidicos con un resto de unión que se une a dicho sitio de unión.

12. El metodo de la reivindicación 11, en el que el sitio de unión es un antigeno.

13. El metodo de la reivindicación 12, en el que el resto de unión es un anticuerpo.

14. El metodo de la reivindicación 11, en el que el sitio de unión es biotina.

15. El metodo de la reivindicación 14, en el que el resto de unión es avidina o estreptavidina.

16. El metodo de la reivindicación 11, en el que el sitio de unión comprende una región Fc o una porción de la misma.

17. El metodo de la reivindicación 16, en el que el resto de unión es proteina A o proteina G.

18. El metodo de la reivindicación 1 o 2, en el que la desacetilasa es histona desacetilasa (HDAC) o una sirtuina.

19. El metodo de la reivindicación 18, en el que la sirtuina es una proteina SIRT1.

20. El metodo de la reivindicación 6 o 7, en el que la acetiltransferasa es Gcn5 o p300/CBP.

21. El metodo de la reivindicación 1, 2, 6 o 7, en el que el reactivo que escinde el sustrato peptidico es una proteasa.

22. El metodo de la reivindicación 21, en el que la proteasa es lisilendopeptidasa, endoproteinasa, Lys-C, plasmina, calpaina o tripsina.

23. El metodo de la reivindicación 1, 2, 6 o 7, en el que el fluoróforo es MR121 o 5TMR.

24. El metodo de la reivindicación 1, 2, 6 o 7, en el que la secuencia del sustrato peptidico deriva de una histona, una proteina HMG, p53, c-Myb, GATA-1, EKLF, MyoD, E2F, dTCF o Tat de VIH, o un fragmento de las mismas.

25. El metodo de la reivindicación 2 o 7, en el que el compuesto es una molecula pequena.

26. El metodo de la reivindicación 2, en el que se identifica un compuesto que aumenta la actividad de la desacetilasa.

27. El metodo de la reivindicación 28, en el que una reducción en el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparación con un control, es indicativa de un compuesto que aumenta la actividad de la desacetilasa.

28. El metodo de la reivindicación 2, en el que se identifica un compuesto que inhibe la actividad de la desacetilasa.

29. El metodo de la reivindicación 28, en el que un aumento del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del compuesto de ensayo, en comparación con un control, es indicativo de un compuesto que inhibe la actividad de la desacetilasa.

30. El metodo de la reivindicación 7, en el que se identifica un compuesto que inhibe la actividad de la acetiltransferasa.

31. El metodo de la reivindicación 30, en el que una reducción del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos tras el contacto con la acetiltransferasa en presencia del compuesto de ensayo, en comparación con un control, es indicativa de un compuesto que inhibe la actividad de la acetiltransferasa.

32. El metodo de la reivindicación 7, en el que se identifica un compuesto que aumenta la actividad de la acetiltransferasa.

33. El metodo de la reivindicación 32, en el que un aumento del valor de polarización de fluorescencia del

conjunto de sustratos peptidicos tras el contacto con la acetiltransferasa en presencia del compuesto de ensayo, en 5 comparación con un control, es indicativo de un compuesto que aumenta la actividad de la acetiltransferasa.

34. Un metodo para determinar la actividad de una enzima que modula la acetilación de un sustrato peptidico que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilación, en el que dichos miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y al menos un residuo de lisina o 10 residuo de lisina acetilada;

poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisión que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;

en el que un cambio del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos es indicativo de 15 actividad de una enzima que modula la acetilación.

35. Un metodo para identificar un compuesto que modula la actividad de una enzima que modula la acetilación de un sustrato peptidico, que comprende:

poner en contacto un conjunto de sustratos peptidicos con una enzima que modula la acetilación en presencia de un compuesto de ensayo, en el que los miembros de dicho conjunto de sustratos peptidicos comprenden un fluoróforo y 20 al menos un residuo de lisina o residuo de lisina acetilada;

poner en contacto el conjunto de sustratos peptidicos con un reactivo de escisión que escinde los miembros del conjunto de sustratos peptidicos que tienen residuos de lisina no acetilada; y determinar el valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos;

en el que un cambio del valor de polarización de fluorescencia del conjunto de sustratos peptidicos en presencia del 25 compuesto de ensayo es indicativo de un compuesto que modula la actividad de la enzima que modula la acetilación.