DISPOSITIVO PARA ENSAYOS DE FLUJO LATERAL.

Dispositivo para la determinación cualitativa o cuantitativa simultánea de varios analitos unidos a célula y plasmáticos,

en el que al menos un analito es un analito unido a célula, en una muestra líquida, que comprende al menos una membrana (2) con - una zona de alimentación (5) para la aplicación de la muestra líquida, - al menos un grupo de al menos dos zonas indicadoras que pueden interaccionar con los analitos y - al menos una región de absorción (4) que capta el líquido después de pasar por las zonas indicadoras, en el que las zonas indicadoras se encuentran entre la zona de alimentación (5) y una región de absorción (3), caracterizado porque las direcciones de flujo de la zona de alimentación a través de las respectivas zonas indicadoras de un grupo son esencialmente paralelas a una región de absorción (carriles de flujo) y presentan al menos dos carriles de flujo distintos y, en caso de reaccionar las zonas indicadoras con más de un analito unido a célula, las zonas indicadoras para estos analitos no están dispuestas consecutivamente y en el que las zonas indicadoras están dispuestas de modo que la zona indicadora del analito unido a célula está dispuesta distal a la zona de alimentación y la zona indicadora del analito plasmático proximal a la zona de alimentación

Dispositivo para ensayos de flujo lateral La invención se refiere a un dispositivo para ensayo multiparamétrico de flujo lateral-diagonal para sistemas de ensayo biológicos o no biológicos para la determinación cualitativa o cuantitativa simultánea de varios analitos unidos a célula y plasmáticos, en el que al menos un analito es un analito unido a célula, en una muestra líquida, que comprende al menos una membrana con una zona de alimentación para la aplicación de la muestra líquida, al menos un grupo de al menos dos zonas indicadoras que pueden interaccionar con los analitos y al menos una región de absorción que capta el líquido después de pasar por las zonas indicadoras, encontrándose las zonas indicadoras entre la zona de alimentación y una región de absorción, caracterizado porque las direcciones de flujo de la zona de alimentación a través de las respectivas zonas indicadoras de un grupo son esencialmente paralelas a una región de absorción (carriles de flujo) y presentan al menos dos carriles de flujo distintos y, en caso de reaccionar la zonas indicadoras con más de un analito unido a célula, las zonas indicadoras para estos analitos no están dispuestas consecutivamente, y en el que las zonas indicadoras están dispuestas de modo que la zona indicadora del analito unido a célula está dispuesta distal a la zona de alimentación y la zona indicadora del analito plasmático proximal a la zona de alimentación.

Los ensayos de flujo lateral encuentran actualmente numerosas aplicaciones como ensayos rápidos, por ejemplo, como ensayos de embarazo, para la determinación de marcadores de infección o como control antidroga. Una disposición de ensayo de flujo lateral está compuesta conocidamente por un soporte sólido sobre el que se aplica una zona de alimentación para la muestra a analizar, una membrana de separación sobre la que se unen elementos de unión, por ejemplo anticuerpos o antígenos de captura y sobre la que pueden detectarse reacciones de unión, y una región de absorción absorbente que deja fluir la muestra a analizar a través de la membrana de separación.

El documento WO 03/012443 se refiere a un sistema de ensayo de membrana con un “ensayo de dos etapas” y comprende una unidad de ensayo y una unidad posterior de filtración.

El documento WO 99/09410 se refiere a un ensayo para la determinación simultánea de los analitos grupo M de VIH-1, grupo O de VIH-1 y VIH-2 usando polipéptidos específicos de secuencia.

El documento WO 97/32213 describe un dispositivo para la determinación de distintos grupos sanguíneos. El dispositivo comprende una lámina de membrana recubierta con anticuerpo y un soporte de absorción.

Las membranas de ensayo del ensayo de flujo lateral convencional se describen en general con una separación similar a la cromatográfica. El analito en la muestra se une específicamente a los elementos de unión fijados a una membrana, que en general se presentan dispuestos en bandas adyacentes o superpuestas como zonas indicadoras. El complejo de unión se visibiliza mediante partículas indicadoras que en general se encuentran ya desecadas en una almohadilla de liberación de conjugado en la disposición. La almohadilla de liberación de conjugado está situada típicamente entre la zona de alimentación y la membrana. Las partículas indicadoras prerrecubiertas coloreadas están recubiertas, por ejemplo, con un anticuerpo dirigido contra el analito buscado.

El formato de ensayo de flujo lateral habitual es el denominado “ensayo de sándwich” en el que tanto las zonas indicadoras como las partículas indicadoras están cubiertas con ligandos dirigidos contra los analitos buscados, normalmente anticuerpos. A este respecto, el ligando (elemento de unión) está inmovilizado sobre la membrana. El reactivo detector, normalmente un anticuerpo que está unido a partículas de poliestireno coloreadas o metales coloidales, está depositado en la almohadilla de liberación de conjugado de forma lixiviable. Este complejo de unión sirve como partícula indicadora. Después de la aplicación de la muestra a analizar, ésta humedece muy rápidamente la almohadilla de liberación de conjugado, con lo que se movilizan las partículas indicadoras. Las partículas indicadoras migran con el frente de líquido a lo largo de la membrana porosa. El analito encontrado en la muestra se une con el anticuerpo que está acoplado con la partícula indicadora. Cuando la muestra pasa por la zona indicadora, se inmoviliza el complejo de analito/partícula indicadora en la zona indicadora mediante reacción del analito con el anticuerpo unido en la zona indicadora, lo que conduce a una señal visible.

Otro formato de ensayo conocido para analitos pequeños con solo un único determinante antigénico que no puede unirse simultáneamente a dos anticuerpos, es el denominado “ensayo competitivo”. El reactivo detector unido a las partículas indicadoras es normalmente una molécula idéntica o análoga al analito. Las partículas indicadoras están depositadas en la almohadilla de liberación de conjugado. Las partículas indicadoras migran con el frente de líquido a lo largo de la membrana porosa. Cuando la muestra que contiene analito y las partículas indicadoras (que contienen igualmente analito eficaz) pasan por la zona indicadora, se une una parte de las moléculas de analito de la muestra y una parte de las partículas indicadoras a los elementos de unión. Cuanto más analito se encuentre en la muestra, más eficazmente competirá con la unión de las partículas indicadoras, y más débil será la señal. Conocidamente, estas partículas indicadoras predominantemente de oro coloidal o poliestireno, que se fabrican con procedimientos conocidos por el especialista y están recubiertas. En los formatos de ensayos de flujo lateral típicos, se determinan indirectamente los analitos. Se entiende aquí por determinación directa de un analito que el analito se una ya naturalmente a la partícula indicadora (por ejemplo, eritrocito) . En el caso más frecuente de determinación indirecta del analito, la muestra a ensayar contiene en general un componente no unido a célula, por ejemplo plasmático, como analito y son necesarios además de la muestra a ensayar dos componentes reactivos, a saber, partícula indicadora y elemento de unión. En la determinación indirecta, se une el analito en primer lugar con las partículas indicadoras eluídas de la almohadilla de liberación de conjugado, antes de que este complejo se inmovilice entonces mediante una segunda reacción con el elemento de unión en las zonas indicadoras.

En el diagnóstico de grupos sanguíneos serológicos, se detectan parámetros generales que son especialmente importantes con respecto a transfusiones o la enfermedad hemolítica del recién nacido. A este respecto, se trata entre otros de la detección de antígenos sobre la superficie de eritrocitos que son característicos de los grupos sanguíneos. Se encuentran otros sistemas antigénicos importantes también en trombocitos, granulocitos y linfocitos, que desempeñan igualmente un papel en la transfusión y/o el transplante.

En el uso del ensayo de flujo lateral convencional con eritrocitos como partículas indicadoras que tienen unidos los analitos a determinar, por ejemplo antígenos específicos de grupos sanguíneos, se disponen hasta ahora en las zonas indicadoras anticuerpos contra los correspondientes antígenos de grupos sanguíneos como elementos de unión en bandas adyacentes o superpuestas solo en un carril de flujo como, por ejemplo, anti-A o anti-B contra los antígenos de grupos sanguíneos A o B, o anticuerpos contra antígenos del sistema de grupos sanguíneos Rh. A este respecto, los ensayos de flujo lateral convencionales presentan la desventaja de que los eritrocitos unidos a los anticuerpos forman en la muestra una barrera de flujo para otros analitos a analizar, por ejemplo otros antígenos asociados a célula. Mediante la aglutinación o adsorción de células en una banda de elementos de unión presente proximal a la zona de alimentación, no pueden separarse sin trabas y visiblemente otros analitos de la muestra a analizar, particularmente asociados con células o fragmentos celulares, ni consiguientemente pueden detectarse clara o completamente. Esto puede conducir, por ejemplo en una persona que sea positiva del grupo sanguíneo AB Rh D, a un debilitamiento o eliminación de las bandas B y D, lo que podría conducir a una interpretación errónea en el sentido de un grupo sanguíneo A Rh negativo. Hasta ahora, no podía emplearse por tanto el ensayo de flujo lateral especialmente en el diagnóstico de grupos sanguíneos... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para la determinación cualitativa o cuantitativa simultánea de varios analitos unidos a célula y plasmáticos, en el que al menos un analito es un analito unido a célula, en una muestra líquida, que comprende al menos una membrana (2) con

- una zona de alimentación (5) para la aplicación de la muestra líquida,

- al menos un grupo de al menos dos zonas indicadoras que pueden interaccionar con los analitos y

- al menos una región de absorción (4) que capta el líquido después de pasar por las zonas indicadoras,

en el que las zonas indicadoras se encuentran entre la zona de alimentación (5) y una región de absorción (3) , caracterizado porque las direcciones de flujo de la zona de alimentación a través de las respectivas zonas indicadoras de un grupo son esencialmente paralelas a una región de absorción (carriles de flujo) y presentan al menos dos carriles de flujo distintos y,

en caso de reaccionar las zonas indicadoras con más de un analito unido a célula, las zonas indicadoras para estos analitos no están dispuestas consecutivamente y en el que las zonas indicadoras están dispuestas de modo que la zona indicadora del analito unido a célula está dispuesta distal a la zona de alimentación y la zona indicadora del analito plasmático proximal a la zona de alimentación.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que las zonas indicadoras se disponen de modo que el líquido de muestra no atraviese más de una zona indicadora por carril de flujo.

3. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que las zonas indicadoras se disponen en forma diagonal, en V, W, M o N o en serie lineal.

4. Dispositivo según una de las reivindicación 1 a 3, en el que las zonas indicadoras comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, lectinas, antígenos o epítopos antigénicos y/o células o fragmentos celulares.

5. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las zonas indicadoras comprenden particularmente anticuerpos anti-A, B, AB, D, C, c, E, e, Cw y/o K o fragmentos de anticuerpos.

6. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la membrana o las membranas (2) están compuestas preferiblemente por polietileno, nitrocelulosa o nailon.

7. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que detrás de la zona de alimentación (5) y delante de las zonas indicadoras sobre la membrana o membranas (2) está dispuesto al menos un elemento sellante (4) .

8. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la zona de alimentación y las zonas indicadoras comprenden dos membranas distintas.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, en el que en una de las dos membranas detrás del elemento sellante y delante de las zonas indicadoras se aplica una almohadilla de conjugado.

10. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los componentes del dispositivo se aplican para reforzamiento mecánico sobre una capa de soporte (1) .

11. Dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los componentes del dispositivo se integran en una carcasa.

12. Uso del dispositivo según una de las reivindicaciones 1 a 11 para el análisis de sangre, plasma sanguíneo, células sanguíneas, suero, orina o saliva o constituyentes de los mismos.