Ensayo indicador basado en una sola célula para controlar los patrones de expresión génica con una resolución espacio-temporal elevada.

Procedimiento de estudio in vitro de la transcripción génica en una célula o en una estirpe celular que comprendelas etapas siguientes:

a. proporcionar una célula o una estirpe celular, excluyendo una célula o estirpe celular embrionaria humana, enla que ha sido introducido un polinucleótido bicatenario, comprendiendo dicho polinucleótido bicatenario sobresu cadena positiva considerada desde su extremo 5' hasta su extremo 3', (i) un promotor de un gen de interéso varios promotores de varios genes de interés seleccionados de entre genes que son endógenos a la célula,y están sometidos a una perfilación de expresión génica, en el que dicho promotor es reconocido por elmecanismo de transcripción interna de la célula, y, (ii) uno o varios códigos de barras de baliza en el quecada código de barras contiene por lo menos una unidad de código de barras que es un montaje de ADN quecomprende repeticiones en tándem de por lo menos un sitio de unión de reconocimiento de baliza, estandocada sitio de unión compuesto por una secuencia de nucleótidos, y en el que cada uno de dichos códigos debarras se encuentra bajo el control de por lo menos uno de dichos promotores para la transcripción;

b. provocar, silenciar o modular la transcripción del montaje del polinucleótido,

c. poner en contacto la célula o estirpe celular de la etapa a con la(s) sonda(s) de detección que pueden hibridarcon el (los) sitio(s) de unión de reconocimiento de baliza del (de los) código(s) de barras y que son una ovarias balizas moleculares que pueden hibridar con el (los) sitio(s) de unión de baliza del (de los) código(s) debarras, presentando dicha(s) baliza(s) moleculares una estructura de polinucleótido en tallo-lazo y resultandoaptas para la visualización o la medición cuando son hibridadas a su secuencia diana, especialmente de unamanera reversible, en particular en el que la visualización de la hibridación de la(s) sonda(s) de detección consu diana es obtenida como resultado de una fluorescencia que es activada cuando la sonda de detección seune a su secuencia diana.

d. detectar la hibridación entre las sondas de detección y la transcripción de los sitios de unión dereconocimiento del código de barras como un indicador de la actividad de transcripción del promotor delmontaje de polinucleótido.

Ensayo indicador basado en una sola célula para controlar los patrones de expresión génica con una resolución espacio-temporal elevada.

La invención se refiere a un ensayo para controlar los patrones de expresión génica, especialmente en una célula viva, recurriendo a un sistema indicador de la transcripción. El ensayo de la invención proporciona unos medios adecuados para una rápida y alta resolución espacio-temporal de dichos patrones. El ensayo de la invención puede utilizarse además para el seguimiento cuantitativo de la transcripción génica.

La invención proporciona en particular la posibilidad de realizar el ensayo diseñado en células aisladas. Se proporciona también especialmente la posibilidad de realizar el ensayo diseñado en una célula viva.

Así pues, la invención proporciona un ensayo que permite controlar la producción de ARN, en su caso un ARNm específico, en una célula viva.

El campo de aplicaciones de la invención comprende el seguimiento de la expresión génica a fin de determinar o controlar la regulación de la homeostasis celular, la actividad celular o la desregulación de la homeostasis o actividad celular u otros procesos celulares.

La invención permite en particular controlar la expresión génica en las células que se han sometido a prueba de provocación por episodios extracelulares, tales como el estrés causado por agentes patógenos u organismos, fármacos o productos químicos. Las células para su utilización según la invención comprenden cualquier tipo de células procariotas o eucariotas. En un aspecto concreto de la invención, estas células se pueden obtener de un hospedador, especialmente un hospedador mamífero, en particular un paciente afectado con una afección patológica. También comprende la determinación de las interacciones hospedador/patógeno, en la célula viva.

La invención proporciona así unos medios adecuados para un alto rendimiento y un alto contenido de identificación.

Así pues proporciona herramientas para su utilización en estrategias de desarrollo de fármacos, y más en general permite controlar la expresión génica en las células vivas y permite la perfilación de genes con fines de identificación. Las aplicaciones específicas de la invención incluyen el seguimiento de las células de un paciente infectado con organismos o agentes patógenos, tales como bacterias, virus, parásitos. Las células ensayadas como tal puede estar infectadas o no. La invención también proporciona unos medios para el seguimiento de las reacciones inmunitarias en una célula o para el seguimiento del desarrollo o la creación de las células tumorales.

Las células vivas están en constante comunicación con su entorno lo que requiere la adaptación de su fisiología a las circunstancias específicas. Estos episodios de comunicación juegan un papel importante (i) para la interferencia entre células individuales de un organismo (por ejemplo durante el desarrollo) , o (ii) para la respuesta eficaz a la tensión desde el exterior. El estrés puede ser físico (por ejemplo calor) , químico (por ejemplo productos químicos tóxicos) o bioquímico (por ejemplo, bacterias patógenas) .

En general, las células alteran la expresión de genes específicos para ajustarse durante las situaciones descritas anteriormente. En particular, la expresión génica está muy regulada temporalmente lo que permite una respuesta equilibrada celular al estrés. La alteración de este equilibrio conduce a la enfermedad.

En el caso del estrés causado por patógenos, estos factores estresantes han desarrollado estrategias para atacar específicamente y alterar la expresión génica celular del hospedador (Arbibe, L. et al. An injected bacterial effector targets chromatin access for transcription factor NF-kappaB to alter transcription of host genes involved in immune responses. Nat. Immunal. 8, 47-56 (2007) ) . Esto puede conducir a una interferencia con la respuesta inmunitaria del hospedador, y al escape del agente patógeno del seguimiento inmunitario del hospedador (por ejemplo Mycobacterium tuberculosis) (Monack D.M., Mueller A., Falkow S. Persistent bacterial infections: the interface of the pathogen and the host immune system. Nat. Rev. Micrabial. Sep. 2004; 2 (9) :747-65) . Distorsiones similares ocurren durante la desregulación en las enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo artritis o lupus) (Kyttaris V.C., et al.

Immune cells and cytokines in systemic lupus er y thematosus: an update. Curr. Opin. Rh eumatal. Sep. 2005; 17 (5) :518-22) .

Por lo tanto, un conocimiento preciso de las respuestas de expresión génica puesta a sitio es fundamental para entender la base molecular de las reacciones celulares al estrés, o las especificidades de las etapas celulares reguladas durante el desarrollo.

La época posgenómica ha proporcionado una gran cantidad de información de varios sistemas genómicos, lo que permite el análisis de la complejidad de los procesos biológicos a gran escala, y con un alto rendimiento (Barabási,

A.L. y Oltvai, Z.N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nat. Rev. Genet . 5, 101-113 (2004) ) . Los ejemplos de estos son el análisis de proteínas por espectrometría de masas y transcripción y perfilación

de la expresión por chips de proteínas y de ADN (Pepperkok, R. y Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. MaI. Cell Bial. 7, 690-696 (2006) ) .

La comprensión de las interacciones entre los componentes de un sistema biológico y la forma en la que dan lugar a la función es un objetivo clave cuando se estudia la biología de sistemas. La mayor parte de nuestra información actual sobre la activación de genes corriente abajo en muchas cascadas de transducción de señales procede de los datos de chips o de ensayos con gen indicador de proteínas (Pepperkok, R. y Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. MaI. Cell Bi al. 7, 690-696 (2006) ) . Los métodos con chip pueden proporcionar información de la población o "censo" del comportamiento de millones de células. Sin embargo, cada célula está involucrada de la manera más probable en una fase diferente de la respuesta a la cascada de señalización y lo que se mide es una imagen más global y general. Dentro de este panorama mosaico se encuentra la información sobre cuándo las células específicas se dedican en fases específicas de su respuesta génica. Teóricamente ésta puede estar relacionada temporalmente con cuando se activa la vía y ayuda en la montaje de modelos mecánicos de las modalidades de cómo funcionan dichas cascadas de transducción de señal dinámica. Sin embargo la información temporal precisa de dicha respuesta de la transcripción está enmascarada en el "ruido" o las variaciones estocásticas de los datos del chip.

La exploración de macromoléculas en su entorno natural con alta resolución espacio-temporal ha sido posible mediante la utilización de análisis de detección por la imagen por fluorescencia en las células vivas (Pepperkok, R. y Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev . MaI. Cell Bial . 7, 690-696 (2006) , Bastiaens, P.I. y Pepperkok, R. Observing proteins in their natural habitat: the living cell. Trends Biachem. Sci. 25, 631-637 (2000) ; Meyer, T. y Teruel, M.N. Fluorescence imaging of signaling networks. Trends Cell Bial. 13, 101-106 (2003) ; Wouters, F.S., Verveer, P.J. y Bastiaens, P.I. Imaging biochemistr y inside cells. Trends Cell Bial. 11, 203-211 (2001) . En principio, se pueden utilizar para explorar las proteínas en su hábitat natural, interrogando a sus interacciones bioquímicas. Sin embargo, esto no se ha extendido fácilmente a la dinámica de detección por la imagen de la expresión génica, por ejemplo mediante la observación de la transcripción del ARN mensajero. El examen de esta actividad en la célula aislada permitiría la relación temporal entre la activación de una cascada de transducción de la señal (los episodios bioquímicos) y una respuesta de transcripción específica que debe relacionarse con precisión.

Aunque esto se ha intentado con ensayos con genes informadores tales como ensayos con proteína fluorescente o luciferasa, lo que se mide es la lectura de la traducción y no de la transcripción de un solo gen en lo que es lo más probable cientos de genes que participan en una respuesta de la transcripción.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de estudio in vitra de la transcripción génica en una célula o en una estirpe celular que comprende las etapas siguientes:

a. proporcionar una célula o una estirpe celular, excluyendo una célula o estirpe celular embrionaria humana, en la que ha sido introducido un polinucleótido bicatenario, comprendiendo dicho polinucleótido bicatenario sobre su cadena positiva considerada desde su extremo 5’ hasta su extremo 3’, (i) un promotor de un gen de interés

o varios promotores de varios genes de interés seleccionados de entre genes que son endógenos a la célula, y están sometidos a una perfilación de expresión génica, en el que dicho promotor es reconocido por el mecanismo de transcripción interna de la célula, y, (ii) uno o varios códigos de barras de baliza en el que cada código de barras contiene por lo menos una unidad de código de barras que es un montaje de ADN que comprende repeticiones en tándem de por lo menos un sitio de unión de reconocimiento de baliza, estando cada sitio de unión compuesto por una secuencia de nucleótidos, y en el que cada uno de dichos códigos de barras se encuentra bajo el control de por lo menos uno de dichos promotores para la transcripción;

b. provocar, silenciar o modular la transcripción del montaje del polinucleótido,

c. poner en contacto la célula o estirpe celular de la etapa a con la (s) sonda (s) de detección que pueden hibridar con el (los) sitio (s) de unión de reconocimiento de baliza del (de los) código (s) de barras y que son una o varias balizas moleculares que pueden hibridar con el (los) sitio (s) de unión de baliza del (de los) código (s) de barras, presentando dicha (s) baliza (s) moleculares una estructura de polinucleótido en tallo-lazo y resultando aptas para la visualización o la medición cuando son hibridadas a su secuencia diana, especialmente de una manera reversible, en particular en el que la visualización de la hibridación de la (s) sonda (s) de detección con su diana es obtenida como resultado de una fluorescencia que es activada cuando la sonda de detección se une a su secuencia diana.

d. detectar la hibridación entre las sondas de detección y la transcripción de los sitios de unión de reconocimiento del código de barras como un indicador de la actividad de transcripción del promotor del montaje de polinucleótido.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que en un código de barras:

- por lo menos 2 de los sitios de unión de reconocimiento de baliza son contiguos y/o por lo menos 2 de las unidades de baliza son contiguas y/o

- por lo menos 2 de los sitios de unión de reconocimiento de baliza están separados por un separador y/o por lo menos 2 de las unidades de baliza están separadas por un separador y/o,

- el número de sitios de unión de reconocimiento de baliza es de hasta 500 y/o,

- una unidad de código de barras en la que cada secuencia de repetición en tándem está enmarcada por uno o varios sitios de restricción y/o,

- una unidad de código de barras comprende repeticiones en tándem de por lo menos dos sitios de unión de reconocimiento de baliza diferentes, estando cada secuencia de repetición en tándem enmarcada opcionalmente por uno o varios sitios de restricción y/o

- cada unidad de código de barras comprende por lo menos 3 sitios de unión de reconocimiento de baliza diferentes, y/o

- la unidad de baliza presenta una longitud en un intervalo de 16 a 200 nucleótidos.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el polinucleótido comprende además corriente abajo de un promotor, controlado por dicho promotor, un ADN que codifica una proteína marcadora, en el que dicho ADN de codificación está dispuesto bajo el control de los elementos reguladores de la expresión, inclusive, bajo el control de dicho promotor y/o comprende además una secuencia de codificación de un gen de interés, bajo del control de dicho promotor para la transcripción y la expresión.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en el polinucleótido las secuencias de los sitios de unión de reconocimiento de baliza son no mamíferas, especialmente no humanas.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en el polinucleótido un sitio de unión de reconocimiento presenta una de las secuencias siguientes:

5'-TTCTCTTCAAACTTTTCCGCTTTT-3' o, 5'-CGCCAAAACCTATTATCTTAAGTC-3' o, 5'-CTCACCTGCTCTTCTCAGACC-3'

.

5. GCTATAGCACTAAGGTAAGACCC-3' y/o las balizas moleculares presentan una de las secuencias de nucleótidos siguientes:

5'-GCUGC AAAAGCGGAAAAGUUUGAAGAGAA GCAGC-3' o 5'-CGACC GACUUAAGAUAAUAGGUUUUGGCG GGUCG-3'

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la baliza molecular de la sonda de detección es una estructura de polinucleótido en tallo-lazo en el que la parte de lazo del polinucleótido es la secuencia de sonda apta para hibridar específicamente a un sitio de unión de baliza y la parte de tallo consiste en dos brazos formados por las secuencias complementarias una de la otra, alojando cada una de las secuencias de brazo, fijada a su extremo libre que es contrario a la parte de lazo del polinucleótido, uno de un resto fluorescente o de un resto de atenuación no fluorescente en el que dichos restos, cuando están unidos a dichas secuencias de brazo, están suficientemente próximos unos de otros para producir la fluorescencia del resto fluorescente que debe atenuarse por transferencia de energía de resonancia fluorescente, y además dicha parte de lazo del polinucleótido es por lo menos dos veces más larga en los nucleótidos que cada estructura de polinucleótido de brazo.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el resto fluorescente (fluoróforo) se selecciona de entre el grupo de puntos cuánticos y derivados, familia Alexafluor de colorantes, FAM, TET o CAL FluorGold 540, HEX o JOE, VICB , CAL Fluor Orange 560A ; Cy3C o NEDB , Quasar 570A , Oyster 556D; TMR o CAL Fluor Red 590A; ROX

o LC rojo 610E , CAL Fluor Red 610A , rojo Texas, o rojo LC 610E, CAL Fluor Red 610A; LC Rojo 640E o CAL Fluor Red 635A; Cy5C o LC Rojo 670E, Quasar 670A, Oyster 645D, LC rojo 705E o Cy5.5C o ácido 5- (2'aminoetil) aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS) , fluoresceína, antranilamida, cumarina, y quelatos de terbio y en el que el atenuador se selecciona en el grupo de DDQ-IA (absorción máx. 430 !m) , Dabcyl (absorción max. 475) , EclipseB (absorción max. 530) , Iowa Black FQC (absorción máx. 532) , BHQ-1D (absorción máx. 534) , QSY7E (absorción máx. 571) , BHQ-2D (absorción máx. 580) , DDQ-IIA (absorción máx. 630) , Iowa Black RQC (absorción máx. 645) , QSY-21E (absorción máx. 660) , BHQ-3D (absorción máx. 670) , oro, metales de tierras raras o ácido 4- (4'dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL) , rodamina, pirenobutirato, eosina, nitrotirosina, etidio y tetrametil-rodamina.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la parte de lazo de la baliza molecular presenta de 10 a 55 nucleótidos y cada estructura de polinucleótido de brazo presenta de 4 a 16 nucleótidos.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polinucleótido es integrado de manera estable en la célula o en la estirpe celular.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa que consiste en provocar, silenciar o modular la transcripción es obtenida tras la puesta en contacto de la célula o estirpe celular con un factor externo.

11. Procedimiento de estudio de la transcripción génica en una célula o en una estirpe celular, según la reivindicación 10, en el que el factor externo es proporcionado como un banco de compuestos o un banco de organismos, a la célula o estirpe celular.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la transcripción de polinucleótido es estudiada

sobre una sola célula o, sobre una sola base de gen, o sobre una base de genes múltiples en una sola célula.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la transcripción del montaje de polinucleótido es estudiada en tiempo real y/o en el punto final.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la detección de los episodios de unión entre la sonda de detección molecular y el transcrito de los sitios de unión de reconocimiento del (de los) código (s) de barras es cuantitativa.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la actividad de transcripción de 1 a 4, o 1 a 10 o 1 a 15 o 1 a 32 promotores de gen es detectada como resultado de un cambio mensurable resultante de la hibridación, especialmente como una emisión de fluorescencia.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende además la detección de una proteína marcadora expresada codificada por el montaje de polinucleótido y expresada bajo el control de uno de los promotores contenidos en el montaje de polinucleótido.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el promotor contenido en la secuencia de polinucleótidos es seleccionado de entre el grupo de promotores de genes implicados en la respuesta

inmunitaria, especialmente en la respuesta inmunitaria innata, tales como los promotores de los genes de la citocina

o la quimiocina, especialmente los promotores de los genes de la interleucina, o los promotores de los genes de las moléculas de adhesión celular tales como los genes ICAM, los promotores del gen del interferón, o es seleccionado de entre los promotores de los genes que codifican las proteínas asociadas a un tumor.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el polinucleótido expresa una proteína marcadora seleccionada de entre el grupo de proteína fluorescente verde (GFP) , o luciferasa.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para su utilización en el cribado de un banco de ARNi, de un banco de ADN, de un banco de productos químicos o de un banco de organismos patógenos.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para cualquiera de las utilizaciones siguientes:

- la utilización en un procedimiento de diagnóstico de un estado patológico o de un estado infeccioso, o

- en el seguimiento de la respuesta a un tratamiento terapéutico, o

- en un cribado de unos compuestos terapéuticos supuestos, o

- en el cribado de compuestos que interactúan posiblemente con la respuesta inmunológica, o

- para controlar las interacciones entre un patógeno y un hospedador, al nivel de un célula del hospedador o de una célula obtenida a partir de dichas células, especialmente cuando dicha célula está dispuesta en condiciones de resultar infectada con dicho patógeno, o

- para investigar las dianas celulares de un compuesto o de un organismo o agente patógeno.