ENSAYO DE SELECCIÓN DE TOXINAS BOTULÍNICAS.

La presente solicitud de patente reivindica la prioridad, de acuerdo con el título 35, artículo 119(e), del Código de Estados Unidos (U.S.C.), para la solicitud provisional con el número de serie 60/547.591, presentado el 24 de febrero de 2004. Las propiedades miorrelajantes de las toxinas botulínicas (BoNT) se han explotado en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas; véase, por ejemplo, William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004). Por ejemplo, se han propuesto terapias con BoNT para tratar distonia: véase, por ejemplo Kei Roger Aoki y col., Method for treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.319.505 (20 de noviembre, 2001); dolor: véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.464.986 (15 de octubre, 2002); lesiones musculares: véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.423.319 (23 de julio, 2002); enfermedades cardiovasculares: veáse, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxins, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2003/0185860 (2 de octubre, 2003); trastornos neuropsiquiátricos: véase, por ejemplo, Steven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2003/0211121 (13 de noviembre, 2003); lumbalgia: véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2004/0037852 (26 de febrero, 2004); así como otros trastornos neuromusculares: véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Multiple Botulinum Toxins for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2001/0021695 (13 de septiembre, 2001); Kei Roger Auki y col., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2002/0010138 (24 de enero, 2002); Kei Roger Auki y col., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2004/0013692 (22 de enero, 2004). Se han extendido otros usos propuestos de BoNT como neuromoduladores biofarmacéuticos, cubriendo una amplia variedad de tratamientos dirigidos a determinados trastornos que carecen de una base neuromuscular. Por ejemplo, los efectos sobre el sistema nervioso autónomo han permitido desarrollar la terapia con el serotipo A de la toxina botulínica (BoNT/A) para el tratamiento de hiperhidrosis o sudoración axilar, e informes indican que la BoNT/A puede ser un tratamiento eficaz para dolor y tensión miofacial, apoplejía, lesión cerebral traumática, parálisis cerebral, trastornos de motilidad grastrointestinal, incontinencia urinaria, cáncer y migrañas. Por último, se conocen ampliamente aplicaciones cosméticas o terapéuticas de otro tipo. De hecho, se prevé que el uso esperado de la BoNT tanto en tratamientos terapéuticos como cosméticos de seres humanos se extenderá a un abanico cada vez más amplio de enfermedades y alimentos que pueden beneficiarse de las propiedades miorrelajantes de estas toxinas. El uso clínico y terapéutico creciente de toxinas botulínicas precisa de la industria farmacéutica para que realice ensayos precisos de la actividad de BoNT con el fin de, por ejemplo, asegurar formulaciones farmacéuticas precisas y llevar un seguimiento de las normas de control de calidad establecidos. Además, debido al riesgo potencial asociado a cantidades pequeñas de BoNT en productos alimentarios, la industria alimenticia precisa de ensayos de actividad de BoNT, por ejemplo, para validar procedimientos de envasado de nuevos alimentos y para asegurar la inocuidad de los alimentos. Adicionalmente, los ensayos sobre la actividad de BoNT son útiles para identificar moduladores de la actividad de BoNT, por ejemplo, moduladores que reducen la actividad de BoNT que pueden ser útiles como antídotos de tóxinas y moduladores que aumentan la actividad de BoNT que pueden ser útiles para crear formulaciones farmacéuticas más potentes o de mayor duración. La presente invención proporciona ensayos de BoNT novedosos para detectar la presencia de actividad de una BoNT útiles para diversas industrias, tales como, por ejemplo, la industria farmacéutica y la industria alimentaria, y también proporciona ventajas relacionadas. Breve descripción de las figuras FIG. 1: muestra un esquema del paradigma actual del mecanismo de intoxicación con BoNT/A. Este proceso de intoxicación puede describirse como un proceso que comprende cuatro etapas: 1) unión al receptor, en la que la BoNT/A se une a un sistema receptor de BoNT/A iniciando el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, en la que después de la unión de BoNT/A, se produce la endocitosis de una vesícula que contiene el complejo sistema toxina/receptor en la célula; 3) traslocación de la cadena ligera, en la que se piensa que tienen lugar multiples eventos, incluidos cambios en el pH externo de la vesícula, formación de un poro canal que comprende el dominio HN de la cadena pesada de BoNT/A, separación de la cadena ligera de BoNT/A de la cadena pesada, activación enzimática de la cadena ligera y liberación de la cadena ligera activada 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera activada de BoNT/A escinde proteolíticamente sus sustratos de SNARE diana, tales como, por ejemplo, SNAP-25. FIG. 2: muestra un esquema de un FGFR3 y los exones empalmados alternativamente que dan como resultado FGFR3IIIb y FGFR3IIIc La parte superior del diagrama muestra un dibujo generalizado de un FGFR3. El dominio extracelular comprende un péptido señalizador (cuadro etiquetado como SP), tres dominios similares a Ig (bucles etiquetados como IgI, IgII e IgIII) y una caja de ácido (cuadro etiquetado como ácido). Una única región que abarca 2   la membrana comprende el dominio transmembrana (cuadro etiquetado como TM). La porción citoplásmica del receptor comprende el dominio tirosina quinasa. El diagrama del medio muestra un dibujo generalizado de los exones que codifican una isoforma de FGFR3IIIb, en el que el exón 9 se separa del tránscrito primario durante el procesamiento. El diagrama inferior muestra un dibujo generalizado de los exones que codifican una isoforma de FGFR3IIIc, en el que el exón 8 se separa del tránscrito primario durante el procesamiento. FIG. 3: muestra los resultados de electroporación de PURE-A en células HIT-T15. La figura 3 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de liberación de insulina. El gráfico indica que la adición de glucosa a una concentración 25 mM induce la secreción de insulina por parte de células no tratadas (control) y las células sometidas a electroporación sin la adicion de PURE-A (electroporación No PURE-A). No obstante, las células HIT-TI5 en las que se introdujo PURE-A (electroporación PURE-A) mostraron una disminución en la secreción de insulina que indicaba que estas células no eran sensibles a la inducción de secreción de insulina. La figura 3 muestra el resultado de un ensayo de escisión de SNAP-25. El análisis de inmunotransferencia (Western) identificó la presencia de un producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A en células tratadas con PURE-A (electroporación PURE-A), pero no en cada control (control y electroporación No PURE-A), con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizó con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A. FIG. 4: muestra los efectos de electroporación de células HIT-T15 con respecto al tiempo. La figura 4a muestra los resultados de un ensayo de inhibición de liberación de insulina que demuestran que la presencia de la toxina retrasa el crecimiento de células HIT-T15 en comparación con los controles, pero las células tratadas con toxina fueron capaces de replicarse normalmente después de un periodo de recuperación. La figura 4b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que demuestra que la escisión de SNAP-25 se detectó en todos los puntos temporales analizados cuando se introdujo PURE-A en las células, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizó con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A. FIG. 5: muestra células HIT-T15 transformadas con una biblioteca de ADNc cerebral humano y seleccionadas usando perlas magnéticas a las que se ha unido BoNT/A. Las colonias individuales son visibles en la placa y están rodeadas por perlas magnéticas. FIG. 6: muestra los resultados de un ensayo de liberación de insulina a partir de células HIT-T15 que contenían... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. 2. Procedimiento para seleccionar una molécula capaz de competir con el BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A poniendo en contacto dicha muestra con una composición que comprende un FGFR3 y detectando si dicha molécula se une selectivamente a dicho FGFR3, en el que la unión selectiva de dicha molécula a dicho FGFR3 indica que dicha molécula es capaz de competir con BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A y en el que si dicha molécula es BoNT/A, dicho procedimiento no comprende un ensayo de DL50. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de puesta en contacto se realiza in vitro. 4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho FGFR3 se expresa en la superficie de una célula. 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha molécula es BoNT/A. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha molécula comprende un dominio de unión del receptor de una cadena pesada de BoNT/A. 7. Procedimiento según una cualquiera de la reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha molécula es una molécula que se une selectivamente al dominio de unión del receptor de FGFR3 y no es BoNT/A. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha molécula comprende un anticuerpo anti-FGFR3 que se une al dominio de unión del receptor de FGFR3. 9. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha molécula comprende un FGF que se une al dominio de unión del receptor de FGFR3. 10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha molécula de FGF se selecciona del grupo constituido por FGF1, FGF2, FGF4, FGF8 y FGF9. 11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha molécula es una molécula que se une selectivamente al dominio de unión del receptor de FGFR3 y comprende un dominio de proteasa que escinde una proteína SNARE en un sitio diferente al que se escinde por la cadena ligera de BoNT/A. 12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho dominio de proteasa comprende el sitio activo de la cadena ligera de una toxina Clostridial diferente a la BoNT/A. 13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho dominio de proteasa comprende el sitio activo de la cadena ligera de BoNT/E. 14. Procedimiento para determinar la actividad de BoNT/A a partir de una preparación que comprende BoNT/A que comprende el procedimiento de la reivindicación 2. 15. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula contiene de forma transitoria un FGFR3 exógeno. 16. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula contiene de forma estable un FGFR3 exógeno. 17. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicho FGFR3 es un FGFR3 de mamífero, un FGFR3 de ave, un FGFR3 de anfibio o un FGFR3 de pez. 18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho FGFR3 de mamífero es un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de ratón o un FGFR3 de rata. 19. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha composición contiene además un polisialogangliósido G1b. 20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho polisialogangliósido se selecciona del grupo constituido por GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b. 21. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula es una célula neuronal. 88   22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha célula neuronal es una célula neuronal primaria, una célula neuronal inmortalizada o una célula neuronal transformada. 23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha célula neuronal se selecciona del grupo constituido por una célula del neuroblastoma, una célula híbrida neuronal, una célula de la médula espinal, una célula del sistema nervioso central, una célula del córtex cerebral, una célula del ganglio espinal, una célula del hipocampo y una célula de feocromocitoma. 24. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula es una célula no neuronal. 25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha célula no neuronal es una célula no neuronal primaria, una célula no neuronal inmortalizada o una célula no neuronal transformada. 26. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha célula no neuronal se selecciona del grupo constituido por una célula de la pituitaria anterior, una célula suprarrenal una célula pancreática, una célula de ovario, una célula de riñón, una célula del estómago, una célula sanguínea, una célula epitelial, un fibroblasto, una célula del tiroides, un condrocito, una célula muscular, un hepatocito, una célula glandular. 89   FIGURAS   91   92   93   94     96   97   98   99     101   102