Procedimiento para determinar la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma.

Procedimiento para la determinación de la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma,

con el fin de decidir sobre "enfermo respecto a la coagulación" o "sano respecto a la coagulación", caracterizado porque a una muestra de sangre o plasma se añade, en una cantidad definida, una sustancia inhibidora de trombina muy específica y no irreversible, elegida de dipetalogastina I, dipetalogastina II, rodniina e hirudina, se induce la coagulación en la muestra de sangre o plasma mediante la adición de factores extrínsecos e intrínsecos y, después de un tiempo definido, se determina de manera en sí conocida la cantidad consumida de la sustancia inhibidora de trombina añadida.

Procedimiento para determinar la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma. La invención se refiere, además, a un kit para llevar a cabo este procedimiento, así como al kit para uso en un procedimiento para obtener información sobre el estado de coagulación de un paciente.

La coagulación sanguínea en un organismo humano o animal es un proceso complejo, que discurre en fases, el cual es desencadenado por procesos patológicos y fisiológicos y sirve in vivo para la hemostasis. En este caso, tiene lugar la transformación del fibrinógeno soluble, presente en el plasma, en la sustancia de coagulación fibrosagelatinosa, la fibrina, en un proceso de varias etapas (cascada de coagulación) en el que participan al menos 15 factores de coagulación sanguínea diferentes, de los que cada uno, cuando es activado, activa en cada caso al siguiente precursor inactivo.

La serina proteasa trombina es la enzima más importante durante la activación del sistema de coagulación plasmático en el que, mediante complejos de activación generados en varias etapas parciales, de precursores de serina proteasas, que son fijados a través de estructuras de unión especiales (grupos γ-carboxi) a fosfolípidos cargados negativamente mediante inducción de iones calcio y co-factores (FVa, FVIIIa) , son activadas serina proteasas casi en forma de fase sólida (FXI, FIX, FX) . El producto final de la compleja activación de la coagulación, la enzima trombina, abandona como única proteasa su complejo de activación y, por consiguiente, está disponible en forma libre en la circulación sanguínea. Allí, se encuentra con muy distintos sustratos de trombina, los cuales afectan tanto a la proteína de coagulación fibrinógeno como también a células. Con ello, la trombina tiene una función puente entre la coagulación plasmática y los elementos celulares, ante todo las plaquetas sanguíneas, para las que la trombina representa el factor desencadenante de la agregación más potente. Sobre la superficie de fosfolípidos de plaquetas agregadas se encuentran asimismo grandes cantidades de complejos de activación que luego pueden generar trombina. En la cantidad máxima posible de trombina en sangre y en el plasma se puede leer el estado actual de coagulación (“global coagulation state” – estado de coagulación global) de un paciente. Este denominado potencial de generación de trombina permite obtener indicios sobre una hipercoagulabilidad de la sangre (trombofilia) , pero también puede permitir reconocer una sub-función de la formación de trombina (hemofilia, tendencia a la hemorragia) .

En el estado conocido de la técnica se conocen métodos para la medición de la generación de trombina en plasma. Por lo general, esto se realizó con ayuda de ensayos de coagulación globales tales como, por ejemplo, aPTT, tiempo de protrombina, valor de Quick, tiempo de reptilasa, tiempo de batroxobina, etc. Con ensayos de este tipo se determina, sin embargo, sólo un fragmento de la activación de la coagulación. Básicamente, en este caso se añade in vitro, ante todo en acervados de plasma de pacientes, una determinada cantidad de un inductor de la coagulación. Con ello, se activa una cantidad determinada de la actividad de α-trombina, la cual es suficiente para determinar en el tiempo, a través de un sistema de reconocimiento, por norma general el fibrinógeno presente en la muestra, la aparición de la coagulación. En este caso, se activan en principio sólo 5-8 unidades NIH de trombina por cada ml de tanda de coagulación.

Un método para la medición de la generación de trombina en plasma es el procedimiento según Hemker et al. (documento EP 0 420 332) . Con este método de Hemker, empleado en varias modificaciones en la práctica, se vigila con una medición continua la generación de trombina por medio de un sustrato cromógeno, después de la inducción de la coagulación (documentos WO 0052199, WO 03093831, WO 09621740) . Con ello, a cortos intervalos de tiempo se añade como integral de superficie la disociación cromógena del sustrato. La velocidad de la disociación cromógena del sustrato así como la disociación cromógena del sustrato a lo largo del tiempo son tomadas como medida de la generación de trombina. Con este método pueden hacerse mensurables influencias de fármacos inhibidores de la coagulación así como trastornos de la coagulación mediante la generación simultánea de trombina. Sin embargo, el inconveniente de este procedimiento estriba en que, en virtud del principio de medición por medio de sustratos cromógenos o fluorógenos y de procedimientos fotométricos sólo se puede trabajar en materiales translúcidos (plasma o bien plasma rico en plaquetas) . Al mismo tiempo, otro inconveniente estriba en que para la medición, los plasmas deben ser diluidos intensamente, lo cual falsifica las anotaciones de los inhibidores presentes de forma natural. Además, en el caso de estrategias de ensayo de este tipo se produce un enriquecimiento de trombina no fisiológico mediante la inducción permanente de la coagulación, de modo que 2 10

entonces tiene lugar una autolimitación no fisiológica de la acción por parte de inhibidores presentes en la sangre que reaccionan lentamente (p. ej.: α2-macroglobulina) . En el caso de situaciones in vivo, estas grandes cantidades de trombina libre no están disponibles, dado que en sangre no diluida está presente un gran número de sustratos de trombina (fibrinógeno, factores V, VIII y XI, protrombina) , pero también antitrombinas (antitrombina II, co-factor de heparina II, entre otros) , los cuales, en función de la cantidad disponible, bloquean a la trombina de manera eficaz. Además, en el caso de este procedimiento del estado conocido de la técnica, únicamente se mide la activación dinámica de trombina, pero no se produce ninguna medición del punto final de la actividad de coagulación. Por consiguiente, existe la necesidad de un procedimiento fiable para la medición de la capacidad de activación máxima de trombina, es decir, de una medición del punto final de la actividad de coagulación.

La revista Arch. exper. Path. u. Pharmakol, tomo 232, págs. 487-498 (1958) , “La determinación cuantitativa de la protrombina mediante titulación con hirudina”, Franz Markwardt, describe un método para la determinación cuantitativa de la protrombina sobre la base entre hirudina y trombina.

El documento EP 1 367 135 describe un procedimiento para evaluar la formación de trombina en sangre o plasma que afecta a la fase inicial de la generación de trombina. En el caso de este procedimiento, la sangre o muestra de plasma se mezcla con al menos un activador del sistema de coagulación y un sustrato de trombina en una concentración relativamente baja y se determina la liberación del producto de transformación del sustrato de trombina.

El documento US 6.051.390 describe el uso de un inhibidor de trombina que está unido a un soporte de elevado peso molecular, en calidad de marcador molecular para la determinación de la activación de la coagulación en el diagnóstico de la coagulación y la vigilancia de la terapia.

Por consiguiente, la invención se propone proporcionar un procedimiento para medir la capacidad de activación máxima de trombina en sangre o plasma. El procedimiento de acuerdo con la invención debe ser independiente de influencias externas variables tales como, por ejemplo, la temperatura de reacción o el tiempo de reacción, y debe permitir que la activación de trombina hasta el punto final discurra con una seguridad suficiente. Además, el procedimiento debe poderse llevar a cabo también en sangre entera y con muestras de sangre casi no diluidas. Además, el procedimiento debe ser aplicable de manera sencilla y debe permitir obtener una información fiable sobre el estado de coagulación de una muestra de sangre.

Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que este problema se resuelve disponiendo una sustancia inhibidora de trombina muy específica y no irreversible, elegida de dipetalogastina I, dipetalogastina II, rodniina e hirudina, en una cantidad determinada en la muestra de sangre, y luego, después de la inducción de la coagulación, determinando la cantidad consumida de la sustancia inhibidora de trombina añadida.

Por consiguiente, la invención se refiere a un procedimiento para la determinación de la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma, con el fin de decidir... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación de la actividad de coagulación total de una muestra de sangre o plasma, con el fin de decidir sobre “enfermo respecto a la coagulación” o “sano respecto a la coagulación”, caracterizado porque a una muestra de sangre o plasma se añade, en una cantidad definida, una sustancia inhibidora de trombina muy específica y no irreversible, elegida de dipetalogastina I, dipetalogastina II, rodniina e hirudina, se induce la coagulación en la muestra de sangre o plasma mediante la adición de factores extrínsecos e intrínsecos y, después de un tiempo definido, se determina de manera en sí conocida la cantidad consumida de la sustancia inhibidora de trombina añadida.

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2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la inducción de la coagulación se genera mediante un factor tisular y una mezcla a base de ácido elágico y fosfolípidos.

3. Kit para uso para la determinación de la actividad de coagulación total de una muestra de sangre con el fin de 15 decidir sobre “enfermo respecto a la coagulación” o “sano respecto a la coagulación”, caracterizado porque comprende i) una sustancia inhibidora de trombina muy específica y no irreversible, elegida de dipetalogastina I, dipetalogastina II, rodniina e hirudina, ii) factores para la activación extrínseca e intrínseca de la trombina, 20 iii) reactivos y coadyuvantes necesarios.

4. Uso de un kit según la reivindicación 3, para obtener información sobre el estado de coagulación de una muestra de sangre.