PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR 1,5-ANHIDROGLUCITOL Y COMPOSICIÓN REACTIVA PARA DETERMINAR 1,5-ANHIDROGLUCITOL.

Método para la determinación de 1,5-anhidroglucitol y composición de reactivo para la determinación de 1,5anhidroglucitol CAMPO TÉCNICO [0001] La presente invención se refiere a un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol y a una composición de reactivo para determinar el 1,5-anhidroglucitol. TÉCNICA ANTECEDENTE [0002] El 1,5-anhidroglucitol (en lo sucesivo denominado 1,5-AG) es una forma reducida de glucosa en la que la posición C1 está reducida y una pequeña cantidad de 1,5-AG está presente en el cuerpo vivo. Se descubrió que el 1,5-AG es un marcador de control útil para la diabetes (por ejemplo, véase el Documento No de Patente 1 ó 2). Como se describe en el Documento No de Patente 1, el 1,5-AG puede ser un marcador clasificado en algún punto entre el nivel de glucosa en sangre y la hemoglobina Alc (HbAlc). Por lo tanto, se considera que el nivel de 1,5-AG en sangre podría ser un marcador adecuado para pacientes diabéticos leves en su autogestión de la enfermedad. Tabla 1 Marcador Características Nivel de glucosa en sangre 1,5-AG Pueden fluctuar erráticamente hacia arriba y hacia abajo durante un tiempo corto. Indica el nivel de glucosa en sangre de aproximadamente cinco a siete días antes del ensayo. HbAlc Indica el nivel de glucosa medio desde aproximadamente dos meses antes del ensayo. El Documento de Patente 1 describe una 1,5-anhidrofructosa reductasa que cataliza la reducción de 1,5anhidrofructosa a 1,5-anhidromanitol y permite un método sencillo para determinación de especialmente 1,5anhidro-D-fructosa. Debido a que la 1,5-anhidro-D-fructosa es un precursor de 1,5-anhidro-D-glucitoles, la 1,5anhidro-D-fructosa cumple los requisitos para el uso como marcador de diabetes en un método de detección simple y específico de materiales biológicos y fluidos corporales. Por lo tanto, el Documento de Patente 1 describe además ácidos nucleicos que codifican la anhidro-D-fructosa reductasa y el anticuerpo que reconoce la anhidro-D-fructosa reductasa. El Documento de Patente 2 describe una L-sorbosa deshidrogenasa (SDH) y una L-sorbosona deshidrogenasa (SNDH), ambas obtenidas de Gluconobacter oxydans T-100. La SDH y la SNDH del Documento de Patente 2 son enzimas útiles que tienen propiedades preferibles para la producción de ácido 2-ceto-L-gulónico, así como ácido L-ascórbico. [0003] Como se describe en el Documento No de Patente 2, el nivel de 1,5-AG en personas sanas normales indica un componente monosacárido que es el segundo más abundante en la sangre después de la glucosa. De acuerdo con una investigación clínica realizada en una población japonesa, el nivel promedio de 1,5-AG es de 24,6 ± 7,2 (media ± DT) g/ml. El intervalo de fluctuación fisiológica entre individuos es pequeño y el nivel de 1,5-AG apenas se ve influenciado por la fluctuación durante el transcurso de un día o a lo largo de varios días. En general, un macho tiende a tener un nivel de 1,5-AG ligeramente superior a una hembra. El valor de corte es de aproximadamente 14,0 g/ml, donde el 95% de las personas sanas son diagnosticadas como normales. [0004] Como un método de determinación de 1,5-AG se ha usado convencionalmente un método de cromatografía de gases o un método enzimático, como se describe en el Documento No de Patente 1. En el método enzimático, 0,2 ml de una muestra de ensayo de plasma sanguíneo (suero sanguíneo) se someten a un tratamiento de eliminación de proteínas y, después, el contenido de la misma se somete a una minicolumna para eliminar adicionalmente los contaminantes incluidos en la misma. Por consiguiente, la muestra se trata con una piranosa oxidasa (en lo sucesivo denominada PROD). Después, el peróxido de hidrógeno producido por la reacción de oxidación del grupo hidroxilo en la posición C2 de 1,5-AG se tiñe mediante el uso de peroxidasa de rábano picante (HRP) y la absorbancia se mide a 420 nm. Dicha técnica puede mencionarse como un ejemplo del método enzimático. Se ha desarrollado un kit de determinación específico para muestras de sangre usando un método enzimático de este tipo. Documento No de Patente 1: Atsuo KAWAI y Yasuo AKANUMA, "1,5-anhydroglucitol", "Rinsyo-Kensa", vol. 33, Nº 8, agosto 1989, págs 901-907. Documento No de Patente 2: "Medical Technology" (una edición extra), 2002, Vol. 30, Nº 13, "All about 2   diabetes testing - Screening to Testing for Complication", págs. 1498-1499 (Ishiyaku Pub, Inc.). Documento de Patente 1: DE 10 2004 010131 A1 Documento de Patente 2: US 5 861 292 A RESUMEN DE LA INVENCIÓN PROBLEMAS A RESOLVER POR LA INVENCIÓN [0005] Sin embargo, puesto que una PROD, que se usa en la determinación de 1,5-AG de acuerdo con métodos enzimáticos convencionales, tiene un fuerte efecto sobre la glucosa, existe un problema en el que es necesario que una gran cantidad de la glucosa presente en la sangre (por ejemplo, glucosa sanguínea) se elimine para permitir una determinación de 1,5-AG altamente precisa. Si se usa una enzima oxidante de 1,5-AG (incluyendo oxidasa y deshidrogenasa) que tiene un bajo efecto sobre la glucosa en lugar de PROD, la determinación de 1,5-AG podría ser más simple, la precisión de la determinación podría mejorarse o el tiempo de determinación podría cortarse. Por lo tanto, se ha buscado el desarrollo de un método de determinación de 1,5-AG usando una enzima de este tipo. [0006] La presente invención se consiguió en las circunstancias descritas anteriormente. Es decir, un objeto de la presente invención es proporcionar un método de determinación de 1,5-AG que se vea menos afectado por sustancias de interferencia y que pueda conseguir la determinación de 1,5-AG con un grado de precisión superior al método de la técnica anterior. MEDIOS PARA RESOLVER LOS PROBLEMAS [0007] Para conseguir el objeto mencionado anteriormente, la presente invención proporciona los aspectos siguientes. [1] Un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol, que comprende usar (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad de sorbosa deshidrogenasa. [2] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que la proteína se obtiene de una bacteria que pertenece al género Sinorhizobium. [3] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que la proteína se obtiene de Sinorhizobium sp. 97507 FERM P-19428. [4] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con sorbosa es del 100%, la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 10% o superior. [5] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [4], en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 100%, la reactividad de la proteína con D-glucosa es del 10% o menos. [6] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [1], en el que el 1,5-anhidroglucitol incluido en una muestra se ve afectado por la proteína en presencia de un sustrato cromogénico, y se mide la cantidad del sustrato cromogénico reaccionado. [7] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [6], en el que la D-glucosa en la muestra se elimina antes de que el 1,5-anhidroglucitol incluido en la muestra se vea afectado por la proteína. [8] El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con [7], en el que el 1,5-anhidroglucitol incluido en la muestra se ve afectado en presencia del sustrato cromogénico y de un transportador de electrones. EFECTOS DE LA INVENCIÓN [0008] La presente invención puede proporcionar un método de determinación de 1,5-AG que se vea menos afectado por sustancias de interferencia y que pueda conseguir la determinación de 1,5-AG con un grado de precisión superior al método de la técnica anterior. Además, el método de determinación de 1,5-AG de la presente invención puede aplicarse a una muestra clínica tal como plasma sanguíneo, suero, líquido cefalorraquídeo u orina y el 1,5-AG incluido en dichas muestras puede cuantificarse o detectarse rápidamente y de forma sencilla. Además, puede conseguirse una medición a pequeña escala en la presente invención, y la presente invención puede conseguir una detección o cuantificación altamente precisa o sensible del 1,5-AG en un aparato de análisis de exámenes bioquímicos automático o similar que se use en general en ensayos clínicos de laboratorio. 3   BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS [0009] La FIG 1 es un diagrama esquemático que ilustra un primer conjunto de procedimientos para construir un plásmido "pUCNNT2 usado en la producción de una sorbosa deshidrogenasa en el Ejemplo 1. La FIG 2 es un diagrama esquemático... [Seguir leyendo]

1. Un método de determinación de 1,5-anhidroglucitol, que comprende usar (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2; o (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 75% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 y que tiene actividad de sorbosa deshidrogenasa. 2. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína procede de una bacteria que pertenece al género Sinorhizobium. 3. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína procede de Sinorhizobium sp. 97507 FERM P-19428. 4. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con sorbosa es del 100%, la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 10% o superior. 5. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 4, en el que, asumiendo que la reactividad de la proteína con 1,5-anhidroglucitol es del 100%, la reactividad de la proteína con D-glucosa es del 10% o menos. 6. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el 1,5anhidroglucitol incluido en una muestra se ve afectado por la proteína en presencia de un sustrato cromogénico, y se mide la cantidad del sustrato cromogénico reaccionado. 7. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la D-glucosa en la muestra se elimina antes de que el 1,5-anhidroglucitol incluido en la muestra se vea afectado por la proteína. 8. El método de determinación de 1,5-anhidroglucitol de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el 1,5anhidroglucitol incluido en la muestra se ve afectado en presencia del sustrato cromogénico y de un transportador de electrones. 36   37   38   39     41   42   43   44   REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción