Detección y recuento de microorganismos.

Método para detectar y contar microorganismos viables en una muestra de la que se sospecha que contienedichos microorganismos que comprende:

(1) poner en contacto dicha muestra con un recurso nutritivo celular y un inhibidor de la proliferación celular, en elque el recurso nutritivo celular contiene un complemento de crecimiento que comprende un antioxidante,preferiblemente ácido pirúvico (o sal del mismo),

(2) poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda oligonucleotídica marcada por fluorescencia quepuede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichosmicroorganismos, en el que dicha muestra se pone en contacto con al menos una primera sonda y una segundasonda en el que la primera sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicosribosómicos de dichos microorganismos y la segunda sonda puede hibridarse específicamente con al menos unaparte diferente de los ácidos nucleicos ribosómicos de los microorganismos,

(3) detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que los microorganismos son de la especie Legionellapneumophila y en el que el inhibidor de la proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacinoy cefalexina.

Detección y recuento de microorganismos

Descripción

La presente invención se refiere a un método para detectar y contar microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra. La invención también incluye un kit adecuado para su uso en un método de este tipo. Este método y kit permiten cuantificar más rápidamente los microorganismos viables.

Las bacterias Legionella están omnipresentes en entornos mojados o húmedos tales como hábitats acuáticos no marinos y suelo. También pueden encontrarse en instalaciones de agua fría y caliente, torres de refrigeración de sistemas de aire acondicionado y humidificadores de agua.

Legionella, especialmente Legionella pneumophila, son patógenos que pueden provocar una neumonía bacteriana aguda, generalmente conocida como “enfermedad del legionario”, que a menudo es mortal para los individuos infectados.

Tradicionalmente, la detección y recuento de Legionella pneumophila se logra mediante cultivo celular. Este método puede lograrse midiendo bacterias cultivables usando recuento en placa o midiendo microcolonias empleando un método de membrana filtrante. Estas técnicas evalúan bacterias viables por su capacidad para formar una colonia o microcolonia. Desafortunadamente, tales métodos requieren habitualmente entre 3 y 10 días con el fin de permitir que se formen las colonias o microcolonias. Cuando las instalaciones de agua están todavía en funcionamiento, existe un riesgo inaceptable de infección humana durante este tiempo.

Otros métodos para detectar los microorganismos de Legionella totales incluyen técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . La PCR emplea ADN polimerasa para amplificar un fragmento de ADN mediante replicación enzimática in vitro. Durante la progresión de la técnica, el ADN generado se usa como molde para la replicación que provoca una reacción en cadena en la que el molde de ADN se amplifica exponencialmente. La PCR permite que una única o unas pocas copias de un fragmento de ADN se amplifiquen generando millones o más copias del fragmento de ADN. Normalmente, se describe un método de este tipo por Diederen et al., J Med Microbiol. Enero de 2007; 56 (Pt 1) :94-101.

Sin embargo, un inconveniente de la PCR es que las muestras tienden a contener inhibidores de la reacción de polimerización y por tanto no proporcionan de manera sistemática resultados cuantitativos. Además, la técnica se basa en una etapa de purificación de ADN previa que puede dar como resultado pérdida de ADN con la consiguiente subestimación de la Legionella presente. Hasta cierto punto, estas desventajas se superan mediante la PCR en tiempo real, que es cuantitativa. Sin embargo, la técnica no puede distinguir entre células viables y células no viables.

Otra técnica es la hibridación fluorescente in situ (FISH) en la que una sonda oligonucleotídica marcada mediante una sustancia fluorescente penetra en las células bacterianas. Cuando los ácidos nucleicos ribosómicos (ARNr) tienen la secuencia correcta para la sonda conocida como diana, la sonda se unirá por sí misma a su diana y no se eliminará mediante ninguna etapa de lavado posterior. Las bacterias en las que se fija la sonda emitirán entonces una señal fluorescente. Esta señal fluorescente puede cuantificarse entonces mediante técnicas tales como citometría de flujo, citometría de fase sólida o microscopía de epifluorescencia. Se describe una técnica de FISH típica por Dutil S et al. J Appl Microbiol. Mayo de 2006; 100 (5) :955-63. Sin embargo, usando la técnica FISH sola, podría detectarse el número total de Legionella pneumophila viables, pero desafortunadamente el método no podría identificar exclusivamente sólo las bacterias Legionella pneumophila que pueden dividirse y como consecuencia formar una colonia.

Un método adicional para contar Legionella pneumophila viables implica ChemChrome V6 y se describe por Delgado-Viscogliosi et al. Appl Environ Microbiol. Julio de 2005; 71 (7) :4086-96. Este método permite la cuantificación de Legionella pneumophila así como la discriminación entre bacterias viables y no viables. Combina la detección específica de células de Legionella usando anticuerpos y un marcador de viabilidad bacteriana (ChemChrome V6) y empleando microscopía de epifluorescencia para el recuento. Sin embargo, aunque esta técnica distingue entre células viables y no viables, no puede identificar por separado las bacterias formadoras de colonias.

Hasta la fecha, los únicos métodos que permiten la detección de bacterias Legionella pneumophila que pueden dividirse se han basado en el método de microcolonias (Scan-VIT) . Sin embargo, este método requiere alrededor de 72 horas.

Arana et al. “Detection and enumeration of viable but non-culturable transconjugants of Escherichia coli during the

survival of recipient cells in river water” págs. 340-346, J. App. Microbiol. Vol. 83, 1997 describen el uso de recuento de viabilidad directa (DVC) usando marcadores específicos.

Piqueres et al. “A combination of direct viable count and fluorescent in situ hybridisation for estimating Helicobacter pylori cell viability” págs. 345-349 Res. Macrobiol. Vol. 157, 2006 Jjemba et al. “In situ enumeration and probing of pyrene degrading soil bacteria” págs. 287-298 FEMS Microbiol. Ecol. Vol. 55, 2006 se refieren ambos a DVC-FISH pero para microorganismos no relacionados con Legionella pneumophila.

El documento EP-A-1852512 describe un método para la identificación y el conteo de varios microorganismos patógenos incluyendo Legionella pneumophila. El método incorpora el recuento de viabilidad directa (DVC) y la hibridación fluorescente in situ (FISH) pero también emplea una sonda auxiliar con el fin de amplificar la señal. Las sondas auxiliares son oligonucleótidos no marcados que se unen a regiones adyacentes a la seleccionada como diana por la sonda marcada específica. Esto potencia la accesibilidad in situ y por tanto la señal conferida por la sonda.

Se dice que el método descrito en el documento EP-A-1852512 emplea un inhibidor de la ADN girasa tal como ácido nalidíxico, que detiene la división celular, aumenta el contenido en ARNr intracelular y la longitud celular de células sensibles. Sin embargo, en la práctica, el ácido nalidíxico no es un inhibidor de la ADN girasa eficaz de manera fiable para Legionella pneumophila. Además, este documento no menciona los problemas de recuento impreciso que pueden producirse debido a la presencia de microorganismos fluorescentes de manera natural.

Sería deseable proporcionar un método para cuantificar de manera fiable Legionella pneumophila viables que pueden formar colonias en una muestra más rápidamente que las técnicas conocidas. Además, sería preferible lograr esto de manera más precisa.

Según la presente invención, se proporciona un método para detectar y contar microorganismos viables en una muestra de la que se sospecha que contiene dichos microorganismos que comprende:

(1) poner en contacto dicha muestra con un recurso nutritivo celular y un inhibidor de la proliferación celular, en el que el recurso nutritivo celular contiene un complemento de crecimiento que comprende un antioxidante, preferiblemente ácido pirúvico (o sal del mismo) ,

(2) poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda oligonucleotídica marcada por fluorescencia que puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichos microorganismos, en el que dicha muestra se pone en contacto con al menos una primera sonda y una segunda sonda en el que la primera sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichos microorganismos y la segunda sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte diferente de los ácidos nucleicos ribosómicos de los microorganismos,

(3) detectar y cuantificar la señal fluorescente,

en el que los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila y en el que el inhibidor de la proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacino y cefalexina.

Generalmente, cada una de las etapas se lleva a cabo secuencialmente, realizándose la etapa (2) en la muestra así tratada en la etapa (1) y luego se lleva a cabo la etapa (3) tras la etapa (2) .

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1. Método para detectar y contar microorganismos viables en una muestra de la que se sospecha que contiene dichos microorganismos que comprende:

(1) poner en contacto dicha muestra con un recurso nutritivo celular y un inhibidor de la proliferación celular, en el que el recurso nutritivo celular contiene un complemento de crecimiento que comprende un antioxidante, preferiblemente ácido pirúvico (o sal del mismo) ,

(2) poner en contacto dicha muestra con al menos una sonda oligonucleotídica marcada por fluorescencia que puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichos microorganismos, en el que dicha muestra se pone en contacto con al menos una primera sonda y una segunda sonda en el que la primera sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichos microorganismos y la segunda sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte diferente de los ácidos nucleicos ribosómicos de los microorganismos,

(3) detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que los microorganismos son de la especie Legionella pneumophila y en el que el inhibidor de la proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacino y cefalexina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el recurso nutritivo celular de la etapa 1) contiene ácido glutámico (o sal del mismo) .

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el recurso nutritivo celular de la etapa 1) contiene ácido glutámico (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo) .

4. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la sonda oligonucleotídica se selecciona del grupo que consiste en una sonda con una secuencia de bases de 5’ a 3’ de ATC TGA CCG TCC CAG GTT; una sonda que tiene una secuencia de bases de 5’ a 3’ de ATCTG ACCG T CCCAG GTT; y una sonda que tiene una secuencia de bases de 5’ a 3’ de AGCTT TCATC CAAAG ATA.

5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que en la etapa (2) dicha muestra se pone en contacto con al menos una primera sonda y una segunda sonda en el que la primera sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos pertenecientes todos al género Legionella y en el que la segunda sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos pertenecientes todos a la especie Legionella pneumophila.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la primera sonda se selecciona del grupo que consiste en una sonda con una secuencia de bases de 5’ a 3’ de CTGGT GTTCC TTCCG ATC; una sonda con una secuencia de bases de 5’ a 3’ de TCGGA CGCAG GCTAA TCT; una sonda con una secuencia de bases de 5’ a 3’ de CCTCC TCCCC ACTGA AAGT; una sonda con una secuencia de bases de 5’ a 3’ de CACTG TATGT CAAGG GTAGG; y una sonda con una secuencia de bases de 5’ a 3’ de AAGGC ATATT CCTAC GCG.

7. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la etapa (3) se lleva a cabo automáticamente usando un microscopio de epifluorescencia.

8. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra se deriva de cualquiera del grupo seleccionado de aguas de refrigeración industrial, agua potable y aguas naturales.

9. Kit para detectar y contar más rápidamente microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra de la que se sospecha que contiene dichos microorganismos, que comprende:

(1) un recurso nutritivo celular, que contiene un complemento de crecimiento que comprende un antioxidante, preferiblemente ácido pirúvico (o sal del mismo) ,

(2) un inhibidor de la proliferación celular,

(3) sondas oligonucleotídicas marcadas por fluorescencia que pueden hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichos microorganismos, que comprenden una primera sonda y una segunda sonda en el que la primera sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte de los ácidos nucleicos ribosómicos de dichos microorganismos y la segunda sonda puede hibridarse específicamente con al menos una parte diferente de los ácidos nucleicos ribosómicos de los microorganismos

(4) un medio para detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que el inhibidor de la proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacino y cefalexina.