Desaturasas.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de:

i) la secuencia de ADN como se representa en la Figura 3a o 3d o que codifica para una secuencia de aminoácido como se representa en la Figura 3b o 3c;

ii) secuencias de ADN que hibridan bajo condiciones rigurosas de hibridación a la secuencias identificadas en (i) anteriormente y que codifican un polipéptido que tiene actividad desaturasa de ácido graso; y

iii) secuencias de ADN que se degeneran como resultado del código genético a la secuencia de ADN definida en (i) y (ii) y codifica una desaturasa de ácido graso.

Desaturasas

La invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de ácidos grasos n-3, particularmente ácido docosahexanoico, o variantes de los mismos; polipéptidos codificados por dichos ácidos nucleicos; células transfectadas con dichas secuencias de ácido nucleico y productos que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico, polipéptidos y/o células.

El DHA, un ejemplo de un ácido graso n-3 puede obtenerse directamente de la dieta o derivarse del metabolismo del ácido linoléico y α-linolénico de la dieta. Para obtener suficientes cantidades de este ácido graso, los seres humanos tiene que comer alimentos ricos en DHA. Actualmente, la fuente dietética principal de DHA es el pescado o el aceite de pescado. Sin embargo, este tiene muchos problemas inherentes; el pescado acumula contaminantes, el aceite extraído tiene un olor desagradable, existe dificultad para controlar la proporción de ácidos grasos deseables específicos a partir de esta fuente y ya que el pescado es una fuente en declive, la demanda en el mercado por el DHA no está siendo satisfecha. Además, los vegetarianos no tienen una fuente de alimentos alternativa obvia para el pescado y por lo tanto la hacen sin DHA o tienen que tomar suplementos puros.

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (PUFA, por sus siglas en inglés) se derivan de los ácidos grasos esenciales (EFA, por sus siglas en inglés) el ácido linoleico (18:2n-6) y el ácido a-linolénico (18:3n-3) , los compuestos parentales de las llamadas familias de EFA omega-3 y omega-6 por una serie alterna de reacciones de desaturación y elongación (Haag, 2001) , ver la Figura 4. El principal producto del metabolito de la vía del n-6 en mamíferos es el ácido araquidónico (AA) (20:4n-6) , mientras que los principales productos finales de la vía del n-3 son el ácido eicosapentanoico (EPA, por sus siglas en inglés) (20:5n-3) y ácido docosahexanoico (DHA, por sus siglas en inglés, 22:6n-3) . La biosíntesis de 18:3n-3 a partir de 18:4n-3 involucra la acción de una Δ6 desaturasa (Horrobin DF, 1992) . Esto es seguido por una reacción de elongación para 20:4n-3 (Sprecher y otros, 1995) y una desaturación Δ5 para 20:5n-3 (Sprecher y otros, 1995) . La visión convencional es que existe después una etapa de elongación posterior que convierte 20:5n-3 en 22:5n-3, lo que es seguido después por una etapa final de desaturación que involucra la actividad de una Δ4 desaturasa para producir ADH (22:6n-3) .

Durante la evolución, los seres humanos han consumido una dieta que contiene aproximadamente igual relación de ácidos grasos esenciales n-3 y n-6 (1-2:1) , pero en los últimos 100-150 años se ha observado un crecimiento de la tendencia de las dietas occidentales hacia el consumo de más ácidos grasos n-6, lo que resulta en una alteración de la relación a 30:1 (Simonpolous, 1999) . Aunque un incremento en el consumo de ácidos grasos n-6 se caracteriza por problemas cardiovasculares tales como incremento de la viscosidad de la sangre, vasoespasmo y vasoconstricción, los ácidos grasos n-3 se asociaron con propiedades promotoras de la salud. Por ejemplo, los ácidos grasos n-3 se describieron como antiinflamatorios, antitrombóticos, antiarrítmicos, hipolipidémicos y vasodilatadores (Simonpolous, 1999) . Como tal, la función del DHA en la prevención y/o tratamiento de enfermedades tales como la enfermedad coronaria del corazón, hipertensión, diabetes tipo II, enfermedades oculares, artritis, fibrosis quística y esquizofrenia y ha sido el foco de muchísima investigación médica.

El efecto de los ácidos grasos poliinsaturados n-3 en enfermedades cardiovasculares ha mostrado que el consumo dietético de DHA puede disminuir el riesgo de infarto del miocardio, hipertensión y complicaciones asociadas con la cirugía cardiaca. Un número de estudios poblacionales correlacionan el consumo de DHA con los factores de riesgo cardiovascular. Por ejemplo, un estudio de una población de esquimales en Canadá (426 sujetos de 18-74 años) , que consumen tradicionalmente grandes cantidades de alimentos marinos ricos en ácidos grasos n-3, mostraron que los ácidos grasos n-3, tales como el DHA se asociaron positivamente con las concentraciones de colesterol-HDL y se asociaron inversamente con las concentraciones de triacilglicerol y la relación del total al colesterol HDL (Dewailly y otros, 2001) . Se concluyó que el alto consumo dietético de ácidos grasos n-3 en la dieta de los esquimales fue probablemente responsable de la baja tasa de mortalidad por enfermedades isquémicas del corazón en esta población.

Los ácidos grasos esenciales son componentes estructurales de todos los tejidos y son indispensables para la síntesis de la membrana celular. Se encontró que el cerebro, la retina y otros tejidos neuronales son particularmente ricos en DHA, donde este se involucra en el desarrollo neuronal y la maduración de los sistemas sensoriales (Uauy y otros, 2000) . Una gran parte de la investigación que compara infantes alimentados con leche de pecho comparada con la leche de fórmula, que es deficiente en DHA y otros ácidos grasos omega 3, concluyó que la presencia de DHA es crítica durante el desarrollo de los recién nacidos (Horrocks y otros, 1999) . El DHA forma 25% del complemento de ácido graso de los glicoesfingolípidos del cerebro y es un componente importante de los bastones de la retina, y por lo tanto una deficiencia en DHA durante el desarrollo del infante se ha asociado con una reducción en la función cognitiva y la agudeza visual. Además, las deficiencias en DHA se han asociado con el síndrome de alcoholismo fetal, trastorno de hiperactividad con déficit de atención, fibrosis quística, fenilcetonuria y adrenoleucodistrofia.

Para satisfacer esta demanda creciente de ácidos grasos n-3 tales como el DHA se han realizado un número de aproximaciones. Los métodos para mejorar el contenido de DHA de la carne mediante la manipulación de la alimentación animal ha sido satisfecha con poco éxito. El cultivo de micro-organismos marinos tales como el Cr y pthecodinium cohnii y Schizochytrium sp, que son ricos en fuentes de DHA también ha sido satisfecho con éxito limitado ya que el cultivo de algas es técnicamente exigente y costoso (Ashford y otros, 2000) .

Ha habido una investigación limitada enfocada en la identificación de genes involucrados en la biosíntesis de los ácidos grasos n-3 en algas. En un reporte, se describió la identificación de un ADNc que codifica una nueva actividad de elongación específica del ácido graso poliinsaturado C 18-Δ9 a partir de la microalga que produce ácido docosahexanoico (DHA) , Isochr y sis galbana (Qi y otros, 2002) . Esta elongasa de 30 kDa, designada IgASEI, comparte solamente homología limitada con las proteínas animales y fúngicas con actividad de elongación. Cuando la IgASE se expresó en la levadura Saccharomyces cerevisiae, se mostró que alarga específicamente los ácidos grasos poliinsaturados C 18-Δ9, ácido linoleico (C18:2n-6, Δ9, 12 y ácido alfa-linolénico (C18:3, Δ9, 12, 15) , al ácido eicosadienoico (C20:2, Δ11, 14) y ácido eicosatrienoico (C20:3 Δ 11, 14, 17) , respectivamente. Se concluyó que una ruta

11 14

principal para la síntesis del ácido eicosapentanoico (C20:5 Δ, 5, , , 17) y el ácido docosahexanoico (C22: (6

Δ4 7 10 13 16

, , , , , 19) en I. galbana puede involucrar una vía de desaturación de Δ8. Se piensa que las Δ6 y Δ5 desaturasas son enzimas microsomales que son un componente de un sistema de tres enzimas que incluye NADH-citocromo b5 reductasa, citocromo b5, y la desaturasa respectiva (Sprecher, 1981) .

Se ha identificado un número de Δ6 y Δ5 desaturasas. En plantas tales como la hierba borraja (Borago officinalis) , se identificó la A6 desaturasa (Sayanova y otros, 1997) . Las Δ6 y Δ5 desaturasas se identificaron en humanos (Hyekyung y otros, 1999 y Cho y otros, 1999, respectivamente) , en animales tales como el nemátodo; Caenorhabditis elegans (Michaelson y otros, 1998 y Napier y otros, 1998) y en microorganismos eucariotas tales como el hongo Mortierella alpina (Huang y otros, 1999 y Knutzon y otros, 1998) . En el ser humano, las actividades Δ6 y Δ5 desaturasa se encontraron en el músculo esquelético, pulmón, placenta, riñón y páncreas, pero se expresan a altos niveles en el hígado, cerebro y corazón (Hyekyung y... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de:

i) la secuencia de ADN como se representa en la Figura 3a o 3d o que codifica para una secuencia de aminoácido como se representa en la Figura 3b o 3c; ii) secuencias de ADN que hibridan bajo condiciones rigurosas de hibridación a la secuencias identificadas en

(i) anteriormente y que codifican un polipéptido que tiene actividad desaturasa de ácido graso; y iii) secuencias de ADN que se degeneran como resultado del código genético a la secuencia de ADN definida en (i) y (ii) y codifica una desaturasa de ácido graso.

2. Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácido representada en la Figura 3b o la Figura 3c.

4. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 2 caracterizado además porque dicho polipéptido consiste de la secuencia de aminoácido representada en la Figura 3b o 3c.

5. Un vector que incluyen al menos una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.

6. Un vector de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicho ácido nucleico está operativamente unido a un promotor.

7. Un vector de acuerdo con la reivindicación 6 dicho promotor es un promotor inducible o un promotor de desarrollo regulado.

8. Una célula aislada que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7.

9. Una célula de acuerdo con la reivindicación 8 dicha célula se selecciona del grupo que consiste de: una célula de mamífero, una célula de levadura, una célula de alga o una célula de planta.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9 dicha célula es una célula de planta.

11. Una planta que comprende una célula de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Una planta de acuerdo con la reivindicación 11 en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste de: maíz (Zea mays) , canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.) , lino (Linum usitatissimum) , alfalfa (Medicago sativa) , arroz (Or y za sativa) , centeno (Secale cerale) , sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , girasol (Helianthus annus) , trigo (Tritium aestivum) , frijol de soya (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , patata (Solanum tuberosum) , cacahuetes (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium hirsutum) , boniato (Iopmoea batatus) , mandioca (Manihot esculenta) , café (Cofea spp.) , coco (Cocos nucifera) , piña (Anana comosus) , cítricos (Citrus spp.) cacao (Theobroma cacao) , té (Camellia senensis) , banana (Musa spp.) , aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifer indica) , olivo (Olea europaea) , papaya (Carica papaya) , anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia intergrifolia) , almendra (Prunus amygdalus) , remolacha azucarera (Beta vulgaris) , avenas, cebada, vegetales y ornamentales.

13. Una semilla que comprende una célula de acuerdo con la reivindicación 10.

14. Un proceso de fermentación en donde dicho proceso comprende las etapas de:

i) proporcionar un recipiente que contiene una célula de acuerdo con la reivindicación 9 y constituyentes requeridos para la fermentación y biosíntesis de ácido graso; y ii) proporcionar condiciones que conduzcan a la fermentación de la composición líquida contenida en dicho recipiente.

15. Un método para modular el nivel de ácidos grasos o variantes de los mismos en una célula de planta que comprende;

i) proporcionar una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 10; ii) regenerar la célula de planta en una planta; y iii) monitorear la producción de ácido graso por dicha planta.

16. Un método para la producción y opcionalmente la extracción de ácidos grasos que comprende:

i) proporcionar una célula de acuerdo con la reivindicación 9 o 10; ii) proporcionar condiciones que conduzcan al crecimiento de dicha célula; y iii) extraer los ácidos grasos o variantes de los mismos de dicha célula.

17. Un método para la producción y opcionalmente la extracción de ácidos grasos que comprende:

i) proporcionar una célula de planta de acuerdo con la reivindicación 10; ii) regenerar dicha célula en una planta; y

iii) extraer los ácidos grasos o variantes de los mismos de dicha planta.

18. Un recipiente de reacción que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, y sustratos de ácido graso caracterizados porque dicho recipiente se adapta para la conversión de los sustratos de ácido graso contenidos en el mismo.

19. Un recipiente de reacción de acuerdo con la reivindicación 18 en donde dicho polipéptido se expresa por una célula de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.

20. Un recipiente de reacción de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 en donde dicho recipiente es un biorreactor.