Método para producir contrucciones óseas tridimensionales mineralizadas,

comprendiendo dicho método:

cultivar precursores de osteoclastos y osteoblastos en un medio de cultivo sin matriz mediante una técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en condiciones eficaces para formar agregados que comprenden dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos, y cultivar dichos agregados mediante dicha técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en un medio de cultivo de mineralización sin matriz que favorece la mineralización de dichos agregados.

Construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

Campo de la invención

La invención se refiere a construcciones óseas tridimensionales mineralizadas obtenidas ex vivo que son una réplica del hueso natural.

Antecedentes

Uno de los problemas principales asociados al estudio del hueso normal y el fisiopatológico es que, como sistema orgánico, crece lentamente y el tiempo para que muestre una respuesta observable a un estímulo particular es relativamente extenso. La naturaleza de la matriz del tejido mineralizado del hueso in vivo y su arquitectura compleja también presentan varios problemas técnicos asociados a la forma de realizar las observaciones experimentales. En la actualidad, los estudios verdaderamente informativos diseñados para comprender la fisiología del hueso se han basado principalmente en la retirada de muestras de tejido óseo de un tejido normal o enfermo en un contexto clínico o de modelos animales experimentales.

Hasta la fecha, no hay un modelo de cultivo de tejidos tridimensional para el hueso, tanto si es de origen animal como humano. La técnica previa se ha basado principalmente en el uso de cultivos de tipos celulares con un solo tipo de osteoblastos o de osteoclastos que se hacen crecer en superficies de cultivo de tejidos bidimensionales planas. Estos cultivos también se han hecho crecer en geles tridimensionales con soporte de colágeno y algunos investigadores han utilizado sistemas de cultivo que permiten aplicar distintos tipos de tensión mecánica a las células para estudiar los efectos de la carga mecánica. Sin embargo, estos cultivos se han centrado principalmente en las respuestas de un solo tipo de célula, tales como los osteoblastos, a diferentes estímulos ambientales.

Los modelos existentes de cultivo plano de tejidos con un solo tipo de célula del hueso no permiten estudiar las interacciones entre los diferentes tipos de células presentes en el hueso normal responsable de la remodelación ósea normal. El tipo de osteocito inactivo desde el punto de vista del desarrollo presente en la matriz mineralizada del hueso normal in vivo (del la que proceden los osteoblastos) todavía se tiene que caracterizar totalmente en un modelo de cultivo de tejidos debido a su supuesta transformación en osteoblastos una vez que se han retirado de la matriz ósea y colocado en el cultivo.

Además, el proceso de mineralización, que es esencial para la formación del hueso nuevo, se ha estudiado previamente sólo en cultivos con un solo tipo de osteoblastos. El proceso de mineralización se ha estudiado en tales modelos en ausencia del principal tipo de célula implicado en la retirada del material mineralizado, en particular el osteoclasto. Sin embargo, la interacción compleja entre ambos tipos de células es esencial para la remodelación ósea normal (a saber, formación del hueso y osteólisis) . Si no están presentes ambos tipos de células, es imposible obtener un verdadera representación in vitro/ex vivo de los procesos normales o realmente patológicos implicados en el proceso de remodelación ósea. Como tal, el uso de tales modelos de cultivo con un solo tipo celular para investigar los efectos de las manipulaciones, tales como los fármacos antiosteoporósicos o intervenciones de carga mecánica, tienen poca utilidad debido a la falta de similitud con el estado fisiológico verdadero existente dentro del tejido óseo in vivo. Nakagawa et al (Tissue Eng. 10 (112) , 93-100 (2004) ) describen el cocultivo de osteoblastos y de precursores de osteoclastos en condiciones tridimensionales. Sin embargo, el cocultivo tridimensional se realiza en un armazón polimérico en condiciones estáticas.

Resumen

En un aspecto, la descripción da a conocer métodos para producir construcciones óseas tridimensionales mineralizadas. En una realización, un método comprende el cultivo de precursores de osteoclastos y osteoblastos en un medio de cultivo sin matriz mediante una técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en condiciones eficaces para formar agregados que comprenden dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos, y cultivar dichos agregados mediante dicha técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en un medio de cultivo de mineralización sin matriz que fomenta la mineralización de dichos agregados.

En otra realización, un método comprende el cultivo de precursores de osteoclastos y osteoblastos en un medio de cultivo sin matriz mediante una técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en condiciones eficaces para formar agregados que comprenden los osteoblastos y los precursores de osteoclastos, y el cultivo de los agregados mediante dicha técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en un medio de cultivo de mineralización sin matriz que fomenta la mineralización de dichos agregados.

En otra realización, un método comprende la introducción de precursores de osteoclastos y osteoblastos en un recipiente de cultivo cilíndrico que rota en torno a un eje horizontal sustancialmente central, y el recipiente de cultivo cilíndrico comprende un medio de cultivo sin matriz; el cultivo de los osteoblastos y de los precursores de osteoclastos en el recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja y fomentar la formación de agregados que comprenden los precursores de osteoclastos y dichos osteoblastos; e introducir un medio de cultivo de mineralización sin matriz dentro del recipiente de cultivo cilíndrico y cultivar los agregados durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja.

En otra realización, el método comprende la introducción de precursores de osteoclastos y osteoblastos en un recipiente de cultivo cilíndrico que rota en torno a un eje sustancialmente horizontal central, comprendiendo el recipiente de cultivo cilíndrico un medio de cultivo sin matriz; el cultivo de los osteoblastos y de los precursores de osteoclastos en el recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja y fomentar la formación de agregados que comprenden los precursores de osteoclastos y los mencionados osteoblastos; el cultivo adicional de los agregados en el recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja de modo que crece el tamaño de los agregados y los precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos; y la introducción de un medio de cultivo de mineralización sin matriz en el recipiente de cultivo cilíndrico y cultivar los agregados durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja, en el que se forman las construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

En otro aspecto, la descripción da a conocer una construcción ósea tridimensional mineralizada producida mediante la introducción de los precursores de osteoclastos y los osteoblastos en un recipiente de cultivo cilíndrico que rota alrededor de un eje sustancialmente horizontal central, y el recipiente de cultivo cilíndrico comprende un medio de cultivo sin matriz; el cultivo de los osteoblastos y de los precursores de osteoclastos en el recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja y para favorecer la formación de agregados que comprenden los precursores de osteoclastos y dichos osteoblastos; el cultivo adicional de los agregados en el recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja, de modo que crece el tamaño de los agregados y los precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos; y la introducción de un medio de cultivo de mineralización sin matriz dentro del recipiente de cultivo cilíndrico y el cultivo de los agregados durante la rotación sustancialmente horizontal a una velocidad eficaz para crear las condiciones de cizalla baja, en las que se forman las construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

Breve descripción de los dibujos La figura 1 es un diagrama de flujo de un ejemplo de un método para preparar construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

Las figuras 2A-2B presentan imágenes de construcciones óseas tridimensionales mineralizadas a 14 días de mineralización... [Seguir leyendo]

1. Método para producir contrucciones óseas tridimensionales mineralizadas, comprendiendo dicho método:

cultivar precursores de osteoclastos y osteoblastos en un medio de cultivo sin matriz mediante una técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en condiciones eficaces para formar agregados que comprenden dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos, y cultivar dichos agregados mediante dicha técnica de cultivo de tejidos tridimensional rotacional de cizalla baja en un medio de cultivo de mineralización sin matriz que favorece la mineralización de dichos agregados.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(a) introducir precursores de osteoclastos y osteoblastos en un recipiente de cultivo cilíndrico que rota en torno a un eje horizontal central, comprendiendo dicho recipiente de cultivo cilíndrico un medio de cultivo sin matriz;

(b) cultivar dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos en dicho recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja y para favorecer la formación de agregados que comprenden dichos precursores de osteoclastos y dichos osteoblastos;

(c) cultivar adicionalmente dichos agregados en dicho recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja, por lo que crece el tamaño de dichos agregados y dichos precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos;

(d) introducir un medio de cultivo de mineralización sin matriz en dicho recipiente de cultivo cilíndrico y cultivar dichos agregados durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja, en el que se forman dichas construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) introducir los precursores de osteoclastos y los osteoblastos en un recipiente de cultivo que comprende un medio de cultivo sin matriz;

(b) cultivar dichos precursores de osteoclastos y dichos osteoblastos en condiciones de vector de gravedad aleatorio, en el que se forman los agregados de dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos; y

(c) introducir un medio de cultivo de mineralización sin matriz en dicho recipiente de cultivo y cultivar dichos agregados en condiciones de vector de gravedad aleatorio, en el que se forman las construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) introducir los precursores de osteoclastos y los osteoblastos en un recipiente de cultivo cilíndrico que rota en torno a un eje horizontal central, comprendiendo dicho recipiente de cultivo cilíndrico un medio de cultivo sin matriz;

(b) cultivar dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos en dicho recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja y para favorecer la formación de agregados que comprenden dichos precursores de osteoclastos y dichos osteoblastos; y

(c) introducir un medio de cultivo de mineralización sin matriz en dicho recipiente de cultivo cilíndrico y cultivar dichos agregados durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja, en el que se forman dichas construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, que además comprende entre (b) y (c) :

(b) (1) cultivar además dichos agregados en dicho recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que dicho recipiente de cultivo cilíndrico es un recipiente con una alta proporción de aspecto (HARV) que tiene un diámetro mayor que su altura.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que la rotación horizontal durante la etapa (b) es a una velocidad media más baja que la rotación durante la etapa (c) .

8. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que la proporción de osteoblastos:precursores de osteoclastos introducida en dicho recipiente de cultivo cilíndrico en la etapa (a) es de 2:1 a 3.1.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que se introducen entre 1 millón y 8 millones de osteoblastos en dicho recipiente de cultivo cilíndrico en la etapa (a) .

10. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que se deja que ocurra la etapa (b) durante entre 24 horas y 48 horas.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 4, en el que dicho medio de cultivo sin matriz comprende al menos un factor de crecimiento de osteoblastos y al menos un factor de diferenciación de osteoclastos, en el que el factor de crecimiento es ácido ascórbico y en el que dicho factor de diferenciación de osteoclastos se selecciona entre el grupo que consiste en el ligando del RANK y M-CSF.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 2 o 5, en el que dicho recipiente de cultivo cilíndrico tiene un diámetro de 10 cm y una altura de 1 cm, y en el que la velocidad media de la rotación horizontal en la etapa (b) está entre 2 revoluciones por minuto y 4 revoluciones por minuto.

13. Método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la velocidad media de la rotación horizontal en la etapa (c) está entre 9 revoluciones por minuto y 16 revoluciones por minuto, y en el que la velocidad media de la rotación horizontal en la etapa (b) (1) o (d) está entre 9 revoluciones por minuto y 20 revoluciones por minuto.

14. Construcción ósea tridimensional mineralizada producida por el método que comprende:

(a) introducir precursores de osteoclastos y osteoblastos en un recipiente de cultlvo cilíndrico que rota en torno a un eje horizontal central, comprendiendo dicho recipiente de cultivo cilíndrico un medio de cultivo sin matriz;

(b) cultivar dichos osteoblastos y dichos precursores de osteoclastos en dicho recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja y para favorecer la formación de agregados que comprenden dichos precursores de osteoclastos y dichos osteoblastos;

(c) cultivar además dichos agregados en dicho recipiente de cultivo cilíndrico durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja, por lo que crece el tamaño de dichos agregados y dichos precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos;

(d) introducir un medio de cultivo de mineralización sin matriz en dicho recipiente de cultivo cilíndrico y cultivar dichos agregados durante la rotación horizontal a una velocidad eficaz para crear condiciones de cizalla baja, en el que se forman dichas construcciones óseas tridimensionales mineralizadas.

COMIENZO

Aislar osteoblastos y precursores de osteoclastos de un paciente sano

Inocular los osteoblastos y los precursores de osteoclastos en un biorreactor HARV modificado con un medio de cultivo Etapa de agregación: se dejan agregar los dos tipos de células a una velocidad de rotación baja para favorecer la formación temprana de agregados Después de que haya finalizado el proceso de agregación, se incrementa la velocidad de rotación del biorreactor HARV

Las construcciones óseas crecen en esferoides

Etapa de mineralización: la producción de una matriz cristalina calcificada en el centro del agregado del tejido se desencadena al cambiar el medio de cultivo inicial por un medio que contiene agentes de mineralización

Etapas de caracterización

Observar la distribución espacial de los tipos de células al final del periodo de mineralización mediante imagen de microscopia confocal Marcar la construcción con una sonda fluorescente rastreadora de células e identificar la presencia de las células mediante una serie Z de imágenes confocales Marcar la construcción con tinción con rojo de alizarina S y tinción histoquímica de von Kossa para demostrar la presencia de calcio, fosfato y carbonato Teñir de núcleos de la construcción para indicar la presencia de células nucleadas integradas por toda la matriz cristalina Inmunoteñir la construcción para detectar marcadores celulares de osteoclastos tales como la fosfatasa alcalina. No se ve ningún marcador celular Premarcar las células precursoras de osteoclastos con Cell Tracker-Orange para mostrar que las células precursoras expresan el marcador de la diferenciación de los osteoclastos, a saber, osteocalceína

FIN

FIGURA 1

FIGURA 4