CONJUGADOS DE ANTIGENO-NANOPARTÍCULA DE CARBOHDRATOS Y USOS DE LOS MISMOS COMO AGENTES ANTIMETASTÁSICOS EN EL TRATAMIENTO DE CÁNCER.

Conjugados de antígeno-nanopartícula de carbohidratos y usos de los mismos como agentes antimetastásicos en el tratamiento de cáncer Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la bionanotecnología. Más específicamente, la presente invención se refiere a conjugados de nanopartículas de carbohidratos. La presente invención también se refiere a procedimientos de síntesis de conjugados de nanopartículas de carbohidratos. La presente invención también se refiere a procedimientos de reducción de metástasis de células de carcinoma usando conjugados de nanopartículas de carbohidratos. Antecedentes de la invención Casi todos los organismos vivos tienen carbohidratos enlazados covalentemente a proteínas o lípidos sobre las superficies de sus células. Se ha demostrado que muchos de estos carbohidratos median en muchos fenómenos fisiológicos importantes, tales como la comunicación célula-célula/célula-matriz y la transducción de señal. Como resultado, se cree que los glicanos desempeñan funciones importantes en la patología de muchas enfermedades, por ejemplo, inflamación, restenosis, infeccionas bacterianas/víricas y cáncer. Un rasgo característico establecido de tumorigénesis es la biosíntesis de cadenas de glicanos aberrantes debida a cambios en la expresión de enzimas de glico-procesamiento. Se cree que estas aberraciones se vuelven más marcadas cuando el tumor adquiere un fenotipo más agresivo. Muchos de estos glicanos son antígenos asociados a tumor conocidos que se han usado como haptenos en el desarrollo de vacunas tumorales. Dos de los restos de carbohidratos de superficie celular asociados a cáncer más distribuidos son el antígeno disacárido de Thomsen-Friedenreich ("T" o "TF" o "TF") asociado a tumor (Gal-ß-13-GalNAc-1-O-Ser/Thr) y su correspondiente antígeno monosacárido "TN" o "Tn" o "Tn" o "T nouvelle" (GalNAc-1-O-Ser/Thr). Los antígenos TF y Tn son antígenos carbohidratos clásicos que están protegidos en tejidos sanos y con enfermedades benignas, pero están al descubierto aproximadamente en un 90 % de los carcinomas (por ejemplo, de mama, colon, próstata, vejiga, ovárico y gástrico). Los epítopos Tn y T son moléculas de adhesión a células y tejidos, operativas en la invasión por y metástasis de carcinoma que incluye fases adherentes y proliferativas. Salmer, G. F., J. Mol. Med., 1997 Ag.; 75(8):594-602. Por ejemplo, durante la metástasis, se cree que las células de cáncer liberadas desde un tumor primario al sistema circulatorio segregan glucoproteínas que portan el antígeno TF. Se cree que estas glucoproteínas inducen células endoteliales para expresar la proteína de superficie celular galectina-3, que da lugar a la unión inicial de las células cancerígenas liberadas a las células endoteliales. Se cree que las interacciones proteína-proteína posteriores entre células cancerígenas y células endoteliales están mediadas por integrina, que da lugar a la colonización de las células cancerígenas metastatizadas. En consecuencia, la disrupción de las interacciones de células tumorales-endoteliales mediadas por antígeno usando compuestos sintéticos que imitan o bien enmascaran la estructura de carbohidrato ha sido muy buscada. Glinksy, V. V., et al., Cancer Res., 2001, 61, 4851-4857. A este respecto, hay una necesidad continua de desarrollar compuestos sintéticos que inhiban la adhesión de células tumorales para su uso en productos terapéuticos para cáncer antiadhesivos. La publicación de patente de los EE.UU. N.º 2004/0052729A1 da a conocer materiales y procedimientos para estudiar y modular la interacción de restos que contienen carbohidratos con otras especies, por ejemplo, grupos de átomos metálicos o semiconductores, que se pueden emplear como un sustrato para inmovilizar varios ligandos que comprenden grupos de carbohidratos. Aunque esta publicación de solicitud de patente describe varias nanopartículas de oro recubiertas con carbohidratos, no se cree que los carbohidratos dados a conocer (por ejemplo, lactosa) sean antígenos de carbohidratos asociados a tumor específicos que se expresan (es decir, se presentan) sobre las superficies del tumor. Por tanto, hay una necesidad continua de desarrollar compuestos sintéticos que tengan antígenos de carbohidratos asociados a tumor específicos que se expresan sobre la superficie de células tumorales. Sumario de la invención Para superar los problemas asociados con proporcionar compuestos sintéticos que inhiban la adhesión de células tumorales para su uso en productos terapéuticos para cáncer antiadhesivos, un aspecto de la presente invención proporciona, entre otros, procedimientos de preparación de conjugados antígeno-nanopartícula, que comprenden proporcionar una nanopartícula y conjugar varios antígenos de carbohidrato a la nanopartícula, en los que los antígenos de carbohidrato incluyen antígeno TF. Otro aspecto de la presente invención proporciona un conjugado antígeno-nanopartícula que comprende varios antígenos de carbohidrato conjugados con una nanopartícula, en el que los antígenos incluyen antígeno TF. Otros aspectos de la presente invención incluyen el uso de conjugados antígeno-nanopartícula de la invención para la fabricación de un medicamento para inhibir la metástasis de células de carcinoma en un mamífero. Por ejemplo, los procedimientos de sintetización de nanopartículas conjugadas incluyen enlazar varios antígenos TF a las superficies de nanopartículas de oro. Estas nanopartículas se han inyectado a mamíferos que portan tumores de mama y este 2   tratamiento ha demostrado que evita la metástasis en los pulmones. Breve descripción de los dibujos El resumen anterior, así como la siguiente descripción detallada, se entiende aún más cuando se lee conjuntamente con los dibujos anexos. Con el fin de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran realizaciones ejemplares de la invención; sin embargo, la invención no está limitada a los procedimientos, composiciones, y dispositivos específicos dados a conocer. En los dibujos: Fig 1. (a) Estructura de antígeno de Thomsen Friedenreich, y (b) Estructura de antígeno Tn. Las líneas de las funciones amino y ácido designan la extensión de una cadena de proteína. Fig 2. Implicación supuesta del antígeno T en metástasis de tumor de Glinskii, Cancer Res., 2001, 61, p. 4851. Fig 3. Micrografía electrónica de transmisión de nanopartículas de oro recubiertas de ag-T Fig 4. Procedimiento de una etapa para la preparación nanopartículas de oro en solución acuosa. Fig. 5 Síntesis de bloque de construcción de Tn para la preparación de nanopartículas de Au. Se muestran las condiciones. Adaptado de Carbohydr. Res. 2003, 338, 1925-1935. Fig 6. Síntesis de bloque de construcción de TF para la preparación de nanopartículas de Au. Se muestran las condiciones. Adaptado de Carbohydr. Res. 2003, 338, 1925-1935. Fig 7. Síntesis de nanopartículas de Au recubiertas con antígeno TF y Tn. Fig 8. Caracterización de nanopartículas de oro recubiertas con TF. Se muestran los datos de TEM, RMN, ultrafiltración y análisis elemental. Fig 9. Síntesis de un bloque de construcción de antígeno TF enlazado a PEG específico para la síntesis de nanopartículas de carbohidratos. Fig 10. Nanopartículas recubiertas de azúcar adicionales preparadas en el estudio. Fig 11. Esquema del ensayo de cromatografía de afinidad de lectina que prueba la estereoespecificidad de la interacción de oro con ag-T con la aglutinina del cacahuete (PNA). Fig 12. Comparación de unión de partículas de oro con ag-T a aglutinina del cacahuete conjugada con rodamina o lectina de Pisum sativum. Las partículas de ag-T forman agregados transparentes con la PNA-rodamina pero no con PSA rodamina. Fig. 13. Pulmones del grupo de PBS. Número de lesiones metastásicas contadas manifiestamente visibles, +++>20, ++ (10-20), + (1-9), - (0). Fig. 14. Pulmones del grupo de Ag T. Número de lesiones metastásicas contadas manifiestamente visibles, +++>20, ++ (10-20), + (1-9), - (0). Fig 15. Tabla que resume los niveles de metástasis en pulmones. Fig 16. Tasas de metástasis presentadas como gráficas de barras, grupos tratados con PBS, JAA-F11 y tratados con oro T-Ag, +++ >20, ++ (10-20), + (1-9), - (0). Fig. 17. Curva de Kaplan-Meier de experimento in vivo. (Grupo 1: control con PBS; Grupo 2: tratamiento de oro con Ag T). Fig.18. Resultados de distribución de tamaño de partícula para la muestra TF-HEXPEG-AuNP. Descripción detallada de realizaciones ilustrativas La presente invención se puede entender más fácilmente por referencia a la siguiente descripción detallada de la invención tomada conjuntamente con las figuras y ejemplos adjuntos, que forman una parte de esta divulgación. Se ha de entender que esta invención no está limitada a los dispositivos, procedimientos, condiciones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de preparación de conjugados antígeno-nanopartícula, que comprende: proporcionar una nanopartícula; y conjugar varios antígenos de carbohidrato con la nanopartícula, en el que los antígenos de carbohidrato incluyen antígeno TF. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de antígenos de carbohidrato incluye además antígeno Tn, antígeno Gb1, antígeno GM1, antígeno GM3, antígeno de Lewis Y, o cualquier combinación de los mismos. 3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que se proporcionan varias nanopartículas, y se conjugan varios antígenos de carbohidrato con al menos una porción de las nanopartículas. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que se conjugan varios antígenos de carbohidrato con cada una de las nanopartículas. 5. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que los antígenos de carbohidrato comprenden un grupo de enlace, y el grupo de enlace se conjuga con la nanopartícula. 6. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la conjugación incluye el autoensamblaje de los antígenos de carbohidrato sobre al menos una superficie de la nanopartícula. 7. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que la nanopartícula comprende uno o más grupos de enlace de nanopartícula, y los antígenos de carbohidrato se conjugan con los grupos de enlace de nanopartícula. 8. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que uno o más grupos espaciadores enlazan los antígenos de carbohidrato a la nanopartícula. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el uno o más grupos espaciadores incluyen PEG, una cadena de carbono, una cadena de carbono que incluye azufre, nitrógeno u oxígeno en el esqueleto, incluyendo los polímeros poliacrilamida, una cadena de péptido compuesta toda de unidades de glicina o alanina, o cualquier combinación de las mismas. 10. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además purificar las nanopartículas. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha purificación incluye filtración, centrifugación, electroforesis, cromatografía, cristalización, o cualquier combinación de las mismas. 12. Un conjugado antígeno-nanopartícula que comprende varios antígenos de carbohidrato conjugados con una nanopartícula, en el que los antígenos incluyen antígeno TF. 13. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12, en el que los antígenos incluyen además antígeno Tn, antígeno Gbl, antígeno GM1, antígeno GM3, antígeno Lewis Y, o cualquier combinación de los mismos. 14. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que varios antígenos de carbohidrato son idénticos entre sí. 15. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que al menos una porción de los antígenos de carbohidrato se presenta en el sistema inmunitario en carcinomas humanos durante el crecimiento y la progresión de tumor. 16. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que los antígenos de carbohidrato pueden inducir expresión en la superficie de galectina-3 en células endoteliales. 17. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que al menos uno de varios antígenos de carbohidrato asociados a tumor se conjuga con un grupo espaciador, y el grupo espaciador se conjuga con la nanopartícula. 18. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que el grupo espaciador incluye PEG, una cadena de carbono, una cadena de carbono que incluye azufre, nitrógeno u oxígeno en el esqueleto, un polímero, un péptido, o cualquier combinación de los mismos. 19. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en le que uno o más antígenos de carbohidrato se conjugan con uno o más grupos de enlace, en los que los grupos de enlace se conjugan con la nanopartícula. 20. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que uno o más antígenos de carbohidrato 27   que se conjugan con uno o más grupos espaciadores, los grupos espaciadores se conjugan con uno o más grupos de enlace, y el uno o más grupos de enlace se conjugan con la nanopartícula. 21. El procedimiento de la reivindicación 4 o el conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 19 ó 20, en el que los grupos de enlace incluyen al menos un átomo de azufre, grupo carboxilado, grupo amida, grupo carbamato, grupo carbonato, grupo tiocarbamato, grupo tiocarbonato, grupo tioéter, grupo succinimida, grupo n-hidroxi succinimida, o cualquier combinación de los mismos. 22. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que cada uno de los antígenos de carbohidrato se enlazan covalentemente a uno o más átomos de azufre. 23. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que los antígenos de carbohidrato se enlazan cada uno, individualmente, a uno o más átomos de azufre. 24. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que cada uno de los antígenos de carbohidrato incluyen uno o más aminoácidos. 25. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 22, en el que al menos dos átomos de azufre se enlazan covalentemente entre sí. 26. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 22, en el que al menos uno de los átomos de azufre se une a la nanopartícula. 27. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 26, en el que los enlaces entre los átomos de azufre y la nanopartícula incluyen enlaces covalentes, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, enlaces de van der Waals, o cualquier combinación de los mismos. 28. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que los antígenos de carbohidrato incluyen un disacárido. 29. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 28, en el que el disacárido comprende al menos un grupo de amino azúcar. 30. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que al menos uno de varios antígenos de carbohidrato es un indicador de pronóstico para cáncer, un marcador de células de carcinoma metastatizadas, una molécula de adhesión implicada en metástasis, o cualquier combinación de los mismos. 31. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que la nanopartícula incluye átomos de oro, átomos de plata, átomos de platino, átomos de rodio, átomos de paladio, o cualquier combinación de los mismos. 32. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 31, en el que la nanopartícula deriva de oro coloidal. 33. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que el conjugado antígeno-nanopartícula tiene un peso molecular en el intervalo de desde aproximadamente 1.000 Dalton a aproximadamente 1 millón de Dalton. 34. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que el número de antígenos de carbohidrato conjugados con la nanopartícula está en el intervalo de desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 1000. 35. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que la nanopartícula tiene de aproximadamente 50 a aproximadamente 10.000 átomos. 36. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 12 ó 13, en el que la nanopartícula tiene una dimensión en el intervalo de desde aproximadamente 0,5 nm hasta aproximadamente 100 nm. 37. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 36, en el que la nanopartícula tiene una dimensión en el intervalo de desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm. 38. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 36, en el que la nanopartícula tiene una forma esferoidal, y el diámetro de la nanopartícula está en el intervalo de desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 10 nm. 39. El conjugado antígeno-nanopartícula de la reivindicación 36, en el que la nanopartícula tiene una forma icosahédrica, cúbica, rómbica, hexagonal, o de fullereno. 40. El conjugado antígeno-nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 12-39, para su uso en tratamiento. 41. Uso del conjugado antígeno-nanopartícula de una cualquiera de las reivindicaciones 12-39, para la fabricación de 28   un medicamento para inhibir la metástasis de células de carcinoma en un mamífero. 42. El procedimiento de la reivindicación 41, en el que el mamífero es un ser humano. 43. El uso de la reivindicación 42, en el que al humano se le diagnostica cáncer. 44. El uso de la reivindicación 43, en el que el cáncer es cáncer de mama. 45. El uso de la reivindicación 44, en el que se inhibe la metástasis de células de pulmón. 46. El uso de la reivindicación 41, que comprende además retirar células de tumor de dicho mamífero. 47. El uso de la reivindicación 46, en el que las células de tumor se retiran de dicho mamífero antes de administrar la cantidad terapéuticamente efectiva de los conjugados antígeno-nanopartícula. 48. El uso de la reivindicación 41, en el que los antígenos de carbohidrato se presentan en el sistema inmunitario en carcinomas humanos durante el crecimiento y la progresión del tumor. 49. El uso de la reivindicación 41, en el que los antígenos de carbohidrato pueden inducir expresión en la superficie de galectina-3 en células endoteliales. 50. El uso de la reivindicación 41, en el que los antígenos de carbohidrato se conjugan con una superficie exterior de dicha nanopartícula. 51. El uso de la reivindicación 41, en el que al menos uno de los antígenos de carbohidrato asociados a tumor se conjuga, individualmente, con al menos un grupo espaciador, y el al menos un grupo espaciador se conjuga con la nanopartícula. 52. El uso de la reivindicación de 51, en el que el grupo espaciador incluye PEG, una cadena de carbono, una cadena de carbono que incluye azufre, nitrógeno u oxígeno en el esqueleto, un polímero, un péptido, o cualquier combinación de los mismos. 53. El uso de la reivindicación 41, en el que uno o más antígenos de carbohidrato se conjuga con un grupo de enlace. 54. El uso de la reivindicación 41, en el que uno o más antígenos de carbohidrato se conjuga, individualmente con un grupo espaciador, y uno o más grupos espaciadores se conjuga a un grupo de enlace. 55. El uso de la reivindicación 54, en el que el grupo de enlace incluye al menos un átomo de azufre, grupo carboxilado, grupo amida, grupo carbamato, grupo carbonato, grupo tiocarbamato, grupo tiocarbonato, grupo tioéter, grupo succinimida, grupo n-hidroxi succinimida, o cualquier combinación de los mismos. 56. El uso de la reivindicación 41, en el que cada uno de los antígenos de carbohidrato se enlaza covalentemente a uno o más átomos de azufre. 57. El uso de la reivindicación 56, en el que al menos dos de los átomos de azufre se unen entre sí. 58. El uso de la reivindicación 56, en el que los antígenos de carbohidrato se enlazan cada uno, individualmente, a uno o más átomos de azufre. 59. El uso de la reivindicación 56, en el que al menos uno de los átomos de azufre se une a al menos una de varias nanopartículas usando NaBH4. 60. El uso de la reivindicación 59, en el que los enlaces entre los átomos de azufre y la nanopartícula se caracterizan porque son enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, enlaces de van der Waals, o cualquier combinación de los mismos. 61. El uso de la reivindicación 41, en el que los antígenos de carbohidrato es un indicador de pronóstico, un marcador de células de carcinoma metastatizadas, una molécula de adhesión implicada en metástasis, o cualquier combinación de los mismos. 62. El uso de la reivindicación 41, en el que al menos una de varias nanopartículas incluye átomos de oro, átomos de plata, átomos de platino, átomos de rodio, átomos de paladio, o cualquier combinación de los mismos. 63. El uso de la reivindicación 62, en el que las nanopartículas incluyen partículas de oro coloidal. 64. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que los pesos moleculares de al menos una porción de los conjugados antígeno-nanopartícula está en el intervalo de desde aproximadamente 1.000 Dalton a aproximadamente 1 millón de Dalton. 29   65. El procedimiento de la reivindicación 64, en el que los pesos moleculares de al menos una porción de los conjugados antígeno-nanopartícula está en el intervalo de desde aproximadamente 10.000 Dalton a aproximadamente 500.000 Dalton. 66. El uso de la reivindicación 41, en el que al menos una porción de los conjugados antígeno-nanopartícula comprende, individualmente, de desde 2 hasta aproximadamente 1000 antígenos de carbohidrato. 67. El uso de la reivindicación 41, en el que al menos una porción de las nanopartículas comprende de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 10.000 átomos. 68. El uso de la reivindicación 44, en el que al menos una porción de las nanopartículas tiene una dimensión en el intervalo de desde aproximadamente 0,5 nm hasta aproximadamente 100 nm. 69. El uso de la reivindicación 68, en el que al menos una porción de las nanopartículas tiene una dimensión en el intervalo de desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 10 nm. 70. El uso de la reivindicación 68, en el que al menos una porción de las nanopartículas comprende una forma esferoide, y la dimensión es el diámetro de la nanopartícula.   31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48