Compuestos maleimido-funanilo útiles en un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido.

Los compuestos de fórmula (I) sustancialmente en forma exo o sus sales, donde: X es un birradical seleccionado entre -(CH2)n-*, -(CH2CH2O)nCH2CH2-*, metilciclohexilo y metilfenilo; n es un número entero que oscila entre 1 y 30; Y es un radical seleccionado entre -COOH, un radical fosforamidito sustituido y N-hidroxisuccinimido éster (u otro éster activo) del ácido carboxílico; y * representa el lugar por donde X se une a Y, son útiles en un procedimiento general para la preparación en fase sólida de derivados maleimido-oligonucleótido.

Compuestos maleimido-furanilo útiles en un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido.

La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología y, en particular, con la nanotecnología, la biología molecular y la terapia génica. En concreto, la presente invención se refiere a compuestos maleimido-furanilo que son útiles como intermedios en un procedimiento general de preparación en fase sólida de derivados maleimido-oligonucleótido.

Estado de la técnica

En la actualidad existe un gran interés en la identificación y desarrollo de oligonucleótidos que sean útiles en terapia y en diagnóstico. El uso de oligonucleótidos en terapia génica tiene como objetivo la inactivación de los genes implicados en el proceso de una enfermedad. Existen varias estrategias para el tratamiento con oligonucleótidos.

La terapia antisentido utiliza oligonucleótidos con la secuencia complementaria al ARNm del gen diana, lo que activa un mecanismo de silenciamiento génico. También se puede usar para alterar la transcripción del gen defectuoso modificando, por ejemplo, su patrón de edición de intrones y exones.

También se hace uso de moléculas pequeñas de ARNi para activar un mecanismo de silenciamiento génico similar al de la terapia antisentido.

Otra posibilidad es utilizar oligodesoxiribonucleótidos como un señuelo para los factores que se requieren en la activación de la transcripción de los genes diana. Los factores de transcripción se unen a los señuelos en lugar de al promotor del gen defectuoso, lo que reduce la expresión de los genes diana. Además, los oligonucleótidos de ADN monocatenario han sido utilizados para dirigir el cambio de una única base dentro de la secuencia de un gen mutante.

Por otro lado, en el diagnóstico se emplean fragmentos de ácidos nucleicos con un marcaje adecuado (tales como las sondas de ADN) para la hibridación específica a un ácido nucleico a detectar. La secuencia específica de la nueva cadena doble se visualiza con ayuda del marcaje. De este modo se pueden detectar enfermedades genéticas, cancerígenas, virales o provocadas por otros agentes patógenos.

Para las aplicaciones mencionadas más arriba, existen varias limitaciones asociadas con el direccionamiento a la célula específica, el transporte a través de la membrana celular y la estabilidad del oligonucleótido. De esta manera, cuando se administra el oligonucleótido con un fin terapéutico o diagnóstico, el resultado obtenido es a veces muy inferior al esperado, ya que o bien no llega a la célula diana, o bien no consigue atravesar la membrana o se degrada.

En los últimos años se han desarrollado protocolos con el fin de superar tales limitaciones. Estos protocolos se basan en la conjugación del oligonucleótido a una molécula que es la que dirige, de manera específica, el oligonucleótido a la célula diana, la que facilita el transporte a través de la membrana celular o la que estabiliza el oligonucleótido. Ejemplos de moléculas que se pueden usar con este fin son los péptidos de penetración celular, lípidos o poliaminas, entre otros (cf. H. Lönnberg, "Solid-phase synthesis of oligonucleotide conjugates useful for delivery and targeting of potential nucleic acids therapeutics", Bioconjugate Chem. 2009, vol. 20, pp. 1065-1094; Y. Singh et al., "Chemical strategies for oligonucleotide-conjugates synthesis", Curr. Org. Chem. 2008, vol. 12, pp. 263-290). Dichas moléculas así como los marcajes que se puedan incorporar a un oligonucleótido se refieren, de aquí en adelante, como "agentes".

En el estado de la técnica se conocen numerosos protocolos mediante los cuales se conjugan oligonucleótidos a agentes del tipo indicado más arriba. En la mayoría de estos protocolos, una de las etapas consiste en derivatizar el oligonucleótido con un grupo funcional. Esta etapa de derivatización es necesaria para poder generar, en etapas posteriores, el conjugado oligonucleótido-agente. En esta etapa de derivatización se puede usar como grupo funcional la maleimida, obteniéndose, de esta manera, derivados maleimido-oligonucleótido. La derivatización con maleimida permite la conjugación posterior de cualquier agente que incluya un grupo nucleófilo, tal como un tiol, o un dieno.

Hasta la fecha, los procedimientos descritos en el estado de la técnica para la preparación de derivados maleimido-oligonucleótido tienen lugar en solución (cf. Harrison G. H. et al., "Synthesis and hybridization analysis of a small library of peptide-oligonucleotide conjugates", Nucleic Acids Res. 1998, vol. 26, pp. 3136-3145; Zanta M. A. et al., "Gene delivery: A single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus", Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, vol. 96, pp. 91-96). Los procedimientos descritos para la obtención de derivados maleimido-oligonucleótido, al tener lugar en solución, presentan problemas de regioselectividad. Esto repercute negativamente en la pureza del derivado maleimido-oligonucleótido resultante y, a su vez, en el rendimiento de dichos procedimientos, ya que la cantidad que se acaba obteniendo del derivado se reduce al ser necesarias etapas posteriores para su purificación. El hecho de que estos procedimientos den lugar a derivados con un rendimiento y pureza bajos repercute en las etapas posteriores, en las que el oligonucleótido, funcionalizado con la maleimida, se conjuga al agente de interés (péptido, proteína, etc) para que el oligonucleótido tenga el efecto terapéutico o diagnóstico deseado. Partiendo de una cantidad pequeña del derivado maleimido-oligonucleótido, se dispone de una cantidad final del oligonucleótido con actividad terapéutica o diagnóstica muy inferior a la inicialmente esperada.

Existe por lo tanto la necesidad de proporcionar procedimientos que permitan obtener derivados maleimido-oligonucleótido con un rendimiento y pureza adecuados.

Explicación de la invención

Los inventores de la presente invención han desarrollado un procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido en fase sólida que es regioselectivo. Este procedimiento comprende, en una primera etapa, el acoplamiento de un grupo maleimido a un oligonucleótido de interés (por tener una aplicación nanotecnológica, diagnóstica o terapéutica deseada), que se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido. Los investigadores han comprobado que cuando el grupo maleimido se encuentra protegido por una porción furanilo, formando de esta manera un nuevo compuesto maleimido-furanilo, la etapa de acoplamiento es regioselectiva. Como consecuencia, el procedimiento general es automatizable, transcurre con rendimientos elevados y permite obtener, al final del procedimiento, un derivado maleimido-oligonucleótido de alta pureza.

Una segunda etapa del procedimiento general de preparación de derivados maleimido-oligonucleótido de la invención es la liberación del derivado oligonucleotídico, del soporte. En este sentido, los inventores han encontrado que el compuesto maleimido-furanilo tiene que estar sustancialmente en configuración exo ya que, a diferencia del isómero endo, el isómero exo es estable en las condiciones en las que el oligonucleótido se libera del soporte.

Adicionalmente, los inventores de la presente invención han encontrado que usando el compuesto maleimido-furanilo de la invención, el cual se caracteriza por comprender grupos metilo en las posiciones 2 y 5 de la porción furanilo, se puede llevar a cabo la reacción de tipo retro-Diels-Alder en unas condiciones más suaves. Esta reacción es la última etapa del procedimiento general de la invención y se lleva a cabo para obtener finalmente el derivado maleimido-oligonucleótido de interés.

Por todo lo anterior, el compuesto maleimido-furanilo diseñado por los investigadores de la presente invención es un intermedio clave en el procedimiento general de la invención.

Así, un primer aspecto la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) sustancialmente en configuración exo, o una sal del mismo:

donde:

X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en:

 

---

Reivindicaciones:

1. Compuesto de fórmula (I) sustancialmente en configuración exo, o una sal del mismo:

donde:

X es un birradical seleccionado del grupo que consiste en:

n es un número entero que oscila entre 1 y 30;

representando * el lugar por donde X se une a Y;

Y es un radical seleccionado del grupo que consiste en:

representando la línea ondulada el lugar por donde Y se une a X;

PG es un grupo protector de fosfato; y

R₁ y R₂ son iguales o diferentes entre sí y se seleccionan entre un radical alquilo C₁-C₁₀ y un radical morfolino.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde R es un radical alquilo C₁-C₁₀.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde PG se selecciona del grupo que consiste en -CH₂CH₂CN, metilo, 2-ciano-1,1-dimetiletilo y p-nitrofeniletilo.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde X es -(CH₂)_n-* o -(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-*, teniendo * el mismo significado que en la reivindicación 1.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde Y es -COOH ó

teniendo la línea ondulada, PG, R₁ y R₂ el mismo significado que en la reivindicación 1.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que se selecciona entre los de fórmulas (Ia) y (Ib).

7. Procedimiento de preparación del compuesto de fórmula (I) definido en la reivindicación 1 en el que Y es -COOH, que comprende las etapas de:

(a) llevar a cabo una reacción Diels-Alder entre un compuesto de fórmula (II) y un compuesto de fórmula (III),

donde X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1, y

(b) llevar a cabo un tratamiento del compuesto obtenido en la etapa (a) con una base nucleófila para aislar el compuesto de fórmula (I).

8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde la etapa (b) de tratamiento con la base nucleófila comprende las subetapas: (b₁) poner en contacto el compuesto obtenido en la etapa (a) con una base nucleófila a temperatura ambiente; (b₂) eliminar la base; (b₃) acidificar el medio resultante a un pH igual o inferior a 3; y (b₄) aislar el producto resultante.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, donde la base nucleófila se selecciona entre amoníaco, una amina primaria y una amina secundaria.

10. Procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula (I) definido en la reivindicación 1 en el que Y es

donde la línea ondulada, PG, R₁ y R₂ tienen el mismo significado que en la reivindicación 1,

que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IV) con un compuesto de fórmula (V):

en un disolvente aprótico y en condiciones anhidras,

donde Z se selecciona entre halógeno y diisopropilamino, y

X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1.

11. Procedimiento de preparación en fase sólida del derivado maleimido-oligonucleótido de fórmula (VI),

donde X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1,

Y' se selecciona entre

donde la línea ondulada representa el lugar por donde Y' se une a X, # representa el lugar por donde Y' se une al oligonucleótido, y PG tiene el mismo significado que en la reivindicación 1;

el procedimiento comprendiendo las siguientes etapas:

(a) acoplar el compuesto de fórmula (I), definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, a un oligonucleótido que se encuentra inmovilizado en un soporte sólido, para obtener el compuesto de fórmula (VII)

donde P es el soporte sólido,

(b) liberar el compuesto de fórmula (VII), resultante de la etapa (a), del soporte sólido para dar lugar al compuesto de fórmula (VIII); y

(c) someter el compuesto de fórmula (VIII) a una reacción retro-Diels-Alder, de manera que se obtiene el derivado de fórmula (VI).

12. Procedimiento según la reivindicación 11, donde la etapa (a) se lleva a cabo en presencia de 4-nitrobencenosulfonato de pentafluorofenilo y 1-hidroxibenzotriazol.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, donde la etapa (b) se lleva a cabo en presencia de una base nucleófila.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde la etapa (c) se lleva a cabo con microondas a una temperatura comprendida entre 80-100ºC.

15. Compuesto de fórmula (VII)

donde

X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1,

Y' se selecciona entre

la línea ondulada representa el lugar por donde Y' se une a X,

# representa el lugar por donde Y' se une al oligonucleótido, y

P es un soporte sólido.

16. Compuesto de fórmula (VIII)

donde

X tiene el mismo significado que en la reivindicación 1,

Y' se selecciona entre

la línea ondulada representa el lugar por donde Y' se une a X, y

# representa el lugar por donde Y' se une al oligonucleótido.

 

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