Una composición que comprende una proteína recombinante, caracterizada porque la proteína comprende delextremo N al extremo C:

i) un fragmento C-terminal de proteína Map3527 que comprende los aminoácidos 183 - 361 de SEQ ID NO: 2;

ii) una secuencia de proteína de Map 1 5 519 que comprende los aminoácidos 1-460 de SEQ ID NO: 3; y

iii) un fragmento N-terminal de proteína Map3527 que comprende los aminoácidos 33 - 180 de SEQ ID NO: 2.

Composiciones para producir una respuesta inmunitaria contra mycobacterium avium subespecie para tuberculosis.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a la estimulación de respuestas inmunológicas, y más específicamente a 5 composiciones y métodos para estimular respuestas inmunológicas profilácticas y/o terapéuticas contra Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) es el agente causal de la enfermedad de John (JD) , que provoca enteritis granulomatosa crónica en rumiantes. Los animales afectados clínicamente desarrollan diarrea 10 crónica y pérdida de peso progresiva que da como resultado inevitablemente la muerte, en tanto que los animales infectados sub-clínicamente presentan una disminución de la producción de leche. La JD tiene una importancia económica extraordinaria en la industria láctea mundial, provocando importantes pérdidas debido a la disminución de la producción y defectos prematuros en los animales con estimaciones de 20% de los rebaños lácteos estadounidenses afectados y costes de 220 millones de dólares al año para la industria láctea (Wells, et al. 2000. J. 15 Am. Vet. Med. Assoc. 216: 1450-1457) . El ganado es muy susceptible a infección con este organismo en los primeros 6 meses de vida, pero la enfermedad comúnmente no se vuelve evidente hasta los 3 a 5 años de edad. La infección ocurre por ingestión de estiercol, calostro o leche contaminada de vacas infectadas (Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract. 12:305-312) . La infección fetal también ocurre, particularmente en vacas preñadas con enfermedad avanzada (Sweeney, et al. 1992. Am. J. Vet. Res. 53:477—480) . Además, la trascendencia de MAP

se ha incrementado significativamente debido de su papel potencial como agente causante de la enfermedad de Crohn en personas (Chamberlin, et al. Aliment Pharmacol Ther 2001; 15 (3) :337-46; Naser SA, et al., Mol Cell Probes 2002; 16 (1) :41-8) .

La vacuna para JD aprobada actualmente para su uso en el campo es una suspensión oleosa de una cepa muerta de MAP, que tiene limitaciones significativas. Principalmente, la eficacia de esta vacuna es cuestionable con 25 resultados variables en diferentes pruebas de vacunación. Otra preocupación es la interferencia de bacterinas de célula completa con las pruebas de diagnóstico, puesto que los animales vacunados tienen reacciones positivas falsas para tuberculosis y para-tuberculosis. Así, está aumentando la demanda de vacunas mejoradas, pero se necesita que sean potentes y al mismo tiempo no deben interferir con la diagnosis de la tuberculosis y la JD. Para lograr este objetivo, se han intentando varios procedimientos, que incluyen vacunas recombinantes, vacunas de

ADN y vacunas de sub-unidades (13; Shin SJ, et al. Infect Immun 2005; 73 (8) :5074-85) . Sin embargo, todavía existe la necesidad de desarrollar vacunas para MAP mejoradas.

La Patente de los Estados Unidos Núm. 7.074.559 82 describe moléculas de ácido nucleico específicas de Mycobacterium paratuberculosis que comprenden una secuencia concreta, polipéptidos codificados por estas moléculas de ácido nucleico específicas de M. paratuberculosis, y anticuerpos que tienen una afinidad de unión 35 específica por los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico específicas de M. paratuberculosis. También se describen los métodos de detección de M. paratuberculosis en una muestra utilizando las moléculas de ácido nucleico, los polipéptidos, y los anticuerpos descritos y describe los métodos para prevenir una infección por

M. paratuberculosis basados en las moléculas de ácido nucleico, los polipéptidos, y los anticuerpos descritos.

La publicación de Li et al., "The complete genome sequence of Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis",

PNAS, Vol. 102, núm. 35, 30 de Agosto de 2005, págs. 12344-12349 se refiere a la provisión de un ensayo diagnóstico para la Enfermedad de Johne bovina. Ésta describe la secuencia genómica de un clon común de MAP así como secuencias específicas de MAP que es probable que sirvan como dianas potenciales para ensayos diagnósticos moleculares e inmunogénicos sensibles y específicos.

Finalmente, la publicación de de la solicitud de patente de los Estados Unidos Núm. 2007/0134274 A1 describe

45 numerosos identificadores genómicos como dianas potenciales para vacunas y otros fármacos contra la enfermedad de Johne. Se describen métodos que se pueden utilizar para liberar un compuesto inmunizante en un mamífero y proporcionar una respuesta inmunitaria contra la enfermedad de Johne o de Crohn en el mamífero.

Compendio de la Invención

La presente invención proporciona composiciones y métodos para estimular una respuesta inmunológica en

50 mamíferos contra MAP. Las composiciones comprenden un nuevo polipéptido recombinante de 79 kDa referido en la presente memoria como “Map74F”. Map74F fue generado al enlazar un fragmento C-terminal de ~17, 6-kDa de la proteína Map3527 a un fragmento de la proteína Map1519, seguido en el extremo C durante una porción N-terminal de 14, 6-kDa de la proteína Map3527.

Además de Map74F, las composiciones de la invención pueden también comprender otras proteínas de MAP, tales

55 como proteínas de MAP 85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD y proteína de tipo ESAT-6 y combinaciones de las mismas.

El método comprende administrar la composición a un mamífero en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunológica contra bacterias MAP. Se espera que el método sea beneficioso para cualquier mamífero susceptible de infección por MAP, pero es particularmente beneficioso para los ruminantes.

Las composiciones pueden ser formuladas con portadores farmacéuticos convencionales y pueden ser administradas vía cualquiera de una variedad de rutas convencionales. Las composiciones pueden ser administradas en cualquier momento a un animal susceptible a contraer infección por MAP o a un animal que está infectado con MAP. Sin embargo, es preferible administrar las composiciones antes de la infección por MAP, por ejemplo mediante administración a animales preñados que pueden transferir componentes inmunológicos profilácticos a sus neonatos vía calostro, o mediante administración durante el período de una a cinco semanas después del nacimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1A proporciona una representación esquemática de un constructo de Map74F. El Map74F fue generado mediante la union sucesiva desde su extremo N a su extremo C de los ORF que codifican un fragmento C-terminal de la proteína Map3527 unido a un ORF que codifica los aminoácidos 1-460 de la proteína de Map 1519, y que terminan con un ORF que codifica un fragmento N-terminal de Map3527. El ORF que codifica Map74F tiene 2397 nucleótidos (nt) y codifica un polipéptido de 799 aa con una masa molecular pronosticada de ~79 kDa.

La Figura 1B proporciona una representación fotográfica de SDS-PAGE al 10% teñida con azul de Coomassie de productos lisados de E. coli de E. coli (BL21/pLysE) transformados con un vector de expresión que codifica Map74F. Las células fueron cultivadas e inducidas con IPTG 1 mM. Las calles ilustran los productos lisados antes (calle UI) o 3 horas después (calle I) de la inducción con IPTG. El Map74F recombinante purificado es mostrado en la calle P junto con el marcador de masa molecular (calle M) .

Las Figuras 2A - 2D proporcionan representaciones gráficas de datos obtenidos de ratones sacrificados 3 semanas después de la vacuna de refuerzo. Las células de bazo de ratones, a los que se había administrado Map74F+ monofosforil lípido A (MPL) y MPL solo fueron estimuladas por 2 días con 10 !g/ml de Map74F, ConA y medio. Para los datos presentados en la Figura 2A, los sobrenadantes de cultivo fueron analizados para determinar los niveles de IFN-y mediante ELISA. Para los datos presentados en la Figura 2B, se realizó el análisis ELIspot para determinar los números relativos de células que expresan IFN-y en suspensiones de bazo unicelulares de ratones inmunizados y ratones de control estimulados con y sin antígenos. En la Figura 2C, se presentan los datos del análisis FACS de células de bazo para determinar las poblaciones de subconjuntos de linfocitos recolectadas... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una proteína recombinante, caracterizada porque la proteína comprende del extremo N al extremo C: i) un fragmento C-terminal de proteína Map3527 que comprende los aminoácidos 183 - 361 de SEQ ID NO: 2;

ii) una secuencia de proteína de Map 1519 que comprende los aminoácidos 1-460 de SEQ ID NO: 3; y iii) un fragmento N-terminal de proteína Map3527 que comprende los aminoácido.

33. 180 de SEQ ID NO: 2.

2. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de la proteína Map1519 comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3.

3. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1.

4. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende además un coadyuvante.

5. La composición de la reivindicación 4, caracterizada porque el coadyuvante se selecciona del grupo que consiste en un monofosforil lípido A (MPL) , bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA) y combinaciones de los mismos.

6. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende además una proteína de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) , en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en proteína 85A de MAP, proteína 85B de MAP, proteína superóxido dismutasa de MAP (SOD) , y combinaciones de las mismas.

7. La composición de la reivindicación 1, para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria a Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) en un mamífero mediante la administración de la composición al mamífero.

8. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque la composición comprende además un coadyuvante.

9. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque el coadyuvante se selecciona del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL) y bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA) .

10. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque la composición es administrada a un rumiante.

11. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque el rumiante es un bovino, una oveja, una cabra, un venado o un alce.

12. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque el rumiante es un bovino.

13. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque el rumiante no está infectado con MAP.

14. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque el rumiante está infectado con MAP.

15. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque el bovino tiene la enfermedad de Johne.

16. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque el animal está preñado.

17. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque la composición comprende además una proteína de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) , donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de proteína 85A de MAP, proteína 85B de MAP, proteína SOD de MAP, y combinaciones de las mismas.

18. La composición de la reivindicación 7, caracterizada porque el polipéptido de la composición comprende la secuencia del SEQ ID NO: 1.