Un procedimiento para fabricar un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora,

comprendiendo el procedimiento:

(a) hacer reaccionar un polisacárido de serotipo 3 purificado con un ácido débil dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 hidrolizado;

(b) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 activado en el que el agente oxidante es ácido peryódico y los cationes bivalentes son Mg2+ o Ca2+;

(c) combinar el polisacárido de serotipo 3 activado con una proteína transportadora;

(d) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 activado y la proteína transportadora combinados con un agente reductor, dando como resultado un conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora; y

(e) proteger los aldehídos que no han reaccionado en el conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora dando como resultado un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora.

Composición multivalente de conjugados de polisacárido neumocócico-proteína Campo de la invención La presente invención se refiere en general al campo de la medicina, y específicamente al de la microbiología, inmunología, vacunas y a la prevención, por inmunización, de infecciones ocasionadas por un patógeno bacteriano.

Antecedentes de la invención

Streptococcus pneumoniae es una causa principal de meningitis, neumonía y enfermedades invasivas graves en bebés y en niños pequeños en todo el mundo. Las vacunas de polisacáridos neumocócicos multivalentes se han autorizado durante muchos años y han demostrado ser valiosas en la prevención de enfermedades neumocócicas en adultos de edad avanzada y en pacientes de alto riesgo. Sin embargo, los bebés y los niños pequeños responden mal a la mayoría de los polisacáridos neumocócicos. La vacuna conjugada neumocócica 7-valente (7vPnC, Prevnar®) fue la primera de este tipo que demostró ser altamente inmunogénica y eficaz contra enfermedades invasivas y otitis media en bebés y en niños pequeños. Actualmente esta vacuna está autorizada en muchos países en todo el mundo. Prevnar contiene los polisacáridos capsulares de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19C y 23F, cada uno conjugado con una proteína transportadora denominada CRM197. Prevnar protege aproximadamente el 8090%, 60-80% y 40%-80% de las enfermedades neumocócicas invasivas (ENI) en los Estados Unidos, Europa y otras regiones del mundo, respectivamente [1, 2]. Como se esperaba, datos de observaciones recogidos durante los años posteriores a la introducción de Prevnar han demostrado claramente una reducción de enfermedades neumocócicas invasivas en bebés en los Estados Unidos (FIG. 1) [3, 4].

La observación de ENI realizada en bebés en los Estados Unidos antes de la introducción de Prevnar demostró que una parte significativa de enfermedades debidas a los serogrupos 6 y 19 se debía a los serotipos 6A (aproximadamente una tercera parte) y 19A (aproximadamente una cuarta parte) [5, 6]. La observación de enfermedades neumocócicas invasivas realizada en los Estados Unidos después de obtener la licencia de Prevnar sugiere que una gran carga de enfermedad todavía puede atribuirse a los serotipos 6A y 19A (FIG. 1) [3]. Además, estos dos serotipos representan más casos de enfermedades invasivas que los serotipos 1, 3, 5 y 7F, combinados (8.2 frente a 3, 3 casos/100.000 niños de 2 años y menores) . Además, los serotipos 6A y 19A están asociados con altos índices de resistencia a antibióticos (FIG. 2) [7, 8, 9]. Aunque a medida que se inmunizan más niños es posible que la protección cruzada de serogrupos de cómo resultado una disminución de enfermedades ocasionadas por los serotipos 6A y 19A, existen pruebas que sugieren que habrá un límite a la disminución, y que permanecerá una carga significativa de enfermedades debida a estos serotipos (véase más adelante) .

Dada la carga relativa y la importancia de enfermedades neumocócicas invasivas debida a los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A, la adición de estos serotipos a la formulación de Prevnar aumentaría la protección para enfermedades invasivas a > 90% en los Estados Unidos y en Europa, y tan alta como 70%-80% en Asia y América Latina. Esta vacuna ampliaría significativamente la protección más allá de Prevnar, y para los serotipos 6A y 19A proporcionaría una protección que no sería dependiente de las limitaciones de la protección cruzada de serogrupos.

Los documentos WO 2006/110381 y US 2006228380 desvelan, entre otras cosas, un procedimiento para producir un conjugado de polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumonia unido covalentemente a una proteína transportadora que comprende una etapa de oxidación usando per y odato de sodio.

Sumario de la invención

La presente descripción proporciona en general una composición inmunogénica multivalente que comprende 13 conjugados distintos de polisacárido-proteína, en la que cada uno de los conjugados contiene un polisacárido capsular de un serotipo de Streptococcus pneumoniae diferente conjugado con una proteína transportadora, junto con un vehículo fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, en la formulación se incluye un adyuvante, tal como un adyuvante basado en aluminio. Más específicamente, la presente descripción proporciona una composición conjugada neumocócica 13-valente (13vPnC) que comprende los siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C y 23F) incluidos en la vacuna 7vPnC más seis serotipos adicionales (1, 3, 5, 6A, 7F y 19A) .

La presente descripción también proporciona una composición inmunogénica multivalente, en la que los polisacáridos capsulares son de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 23F de Streptococcus pneumoniae y la proteína transportadora es CRM197.

La presente descripción proporciona adicionalmente una composición inmunogénica multivalente, en la que los polisacáridos capsulares son de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9v, 14, 18C, 19A y 23F de Streptococcus pneumoniae, la proteína transportadora es CRM197 y el adyuvante es un adyuvante basado en aluminio, tal como fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una realización particular de la invención, el adyuvante es fosfato de aluminio.

La presente descripción también proporciona una composición inmunogénica multivalente, que comprende conjugados de polisacárido-proteína junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados comprende un polisacárido capsular de un serotipo de Streptococcus pneumoniae diferente conjugado con una proteína transportadora, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir del serotipo 3 y de al menos un serotipo adicional.

En una realización de esta composición inmunogénica multivalente, el serotipo adicional se selecciona del grupo que consiste en los serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A y 23F. En otra realización, la proteína transportadora es CRM197. En otra realización adicional, la composición comprende un adyuvante, tal como adyuvante basado en aluminio seleccionado de fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una realización particular el adyuvante es fosfato de aluminio La presente descripción también proporciona una composición inmunogénica multivalente, que comprende conjugados de polisacárido-proteína junto con un vehículo fisiológicamente aceptable, en el que cada uno de los conjugados comprende un polisacárido capsular de un serotipo de Streptococcus pneumoniae diferente conjugado con una proteína transportadora, y los polisacáridos capsulares se preparan a partir de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F y de al menos un serotipo adicional.

En una realización de esta composición inmunogénica multivalente, el serotipo adicional se selecciona del grupo que consiste en los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A. En otra realización, la proteína transportadora es CRM197. En otra realización adicional, la composición comprende un adyuvante, tal como un adyuvante basado en aluminio seleccionado de fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una realización particular, el adyuvante es fosfato de aluminio.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra un conjugado de polisacárido capsular de Streptococcus pneumoniae, que comprende administrar a un ser humano una cantidad inmunológicamente eficaz de cualquiera de las composiciones inmunogénicas que acaban de describirse.

La presente descripción también proporciona que cualquiera de las composiciones inmunogénicas, administradas como una sola dosis de 0, 5 ml, se formule para contener: 2 Ig de cada sacárido, excepto para 6B que es de 4 Ig; aproximadamente 29 Ig de proteína transportadora CRM197; 0, 125 mg de adyuvante de aluminio elemental (0, 5 mg de fosfato de aluminio) ; y tampón de cloruro de sodio y succinato de sodio como excipientes.

También se proporcionan procedimientos para fabricar un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido de serotipo 3 (Pn 3) de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora. En una realización, el procedimiento comprende (i) hacer reaccionar el polisacárido Pn 3 purificado con un ácido suave dando como resultado un polisacárido Pn 3 hidrolizado; (ii) hacer reaccionar el polisacárido Pn 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacárido Pn 3 activado; (iii) combinar el polisacárido Pn 3 activado... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para fabricar un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora, comprendiendo el procedimiento:

(a) hacer reaccionar un polisacárido de serotipo 3 purificado con un ácido débil dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 hidrolizado;

(b) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 activado en el que el agente oxidante es ácido per y ódico y los cationes bivalentes son Mg2+ o Ca2+;

(c) combinar el polisacárido de serotipo 3 activado con una proteína transportadora;

(d) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 activado y la proteína transportadora combinados con un agente reductor, dando como resultado un conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora; y

(e) proteger los aldehídos que no han reaccionado en el conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína

transportadora dando como resultado un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente purificar el polisacárido de serotipo 3 activado antes de combinar con la proteína transportadora.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente co-liofilizar el polisacárido de serotipo 3 activado y la proteína transportadora combinados antes de la reacción con el agente reductor.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente purificar el conjugado inmunogénico.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ácido débil es ácido acético.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proteína transportadora es CRM197.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el agente reductor es cianoborohidruro de sodio.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la protección de los aldehídos que no han reaccionado comprende hacer reaccionar el conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora con borohidruro de sodio.

9. Un procedimiento para fabricar un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora, comprendiendo el procedimiento que comprende:

(a) hacer reaccionar un polisacárido de serotipo 3 purificado con ácido acético dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 hidrolizado;

(b) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 hidrolizado con ácido per y ódico en presencia de MgCl2

dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 activado; 35 (c) purificar el polisacárido de serotipo 3 activado;

(d) combinar el polisacárido de serotipo 3 activado con una proteína transportadora;

(e) co-liofilizar el polisacárido de serotipo 3 activado y la proteína transportadora combinados;

(f) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 activado y la proteína transportadora co-liofilizados con cianoborohidruro de sodio dando como resultado un conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora; y

(g) proteger los aldehídos que no han reaccionado en el conjugado de polisacárido de serotipo 3: proteína transportadora con borohidruro de sodio dando como resultado un conjugado inmunogénico que comprende el polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae unido covalentemente a una proteína transportadora.

45 10. El procedimiento de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente purificar el conjugado inmunogénico.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la proteína transportadora es CRM197.

12. Un procedimiento para fabricar un polisacárido de serotipo 3 de Streptococcus pneumoniae activado, comprendiendo el procedimiento:

(a) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 purificado con un ácido débil dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 hidrolizado; y

(b) hacer reaccionar el polisacárido de serotipo 3 hidrolizado con un agente oxidante en presencia de cationes bivalentes dando como resultado un polisacárido de serotipo 3 activado en el que el agente oxidante es ácido per y ódico y los cationes bivalentes son Mg2+.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, que comprende adicionalmente purificar el polisacárido de serotipo 3 activado después de la oxidación.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el ácido débil es ácido acético.