Clonación de genes que codifican citocromo p450 a partir de Nicotiana.

Una molécula aislada de ácido nucleico de Nicotiana en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 356.

Clonacion de genes que codifican citocromo p450 a partir de Nicotiana La presente invencion se relaciona con secuencias de acido nucleico que codifican enzimas citocromo p450 (de ahora en delante denominadas como enzimas p450 y p450) en plantas de Nicotiana y con metodos para utilizar aquellas secuencias de acido nucleico para alterar fenotipos de plantas.

Antecedentes Las reacciones enzimaticas que catalizan los citocromos p450 para un rango diverso de sustratos quimicamente disimiles que incluyen el metabolismo oxidativo, peroxidativo y reductivo de sustratos endogenos a xenobioticos. En las plantas, las p450 participan en rutas bioquimicas que incluyen la sintesis de productos vegetales tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lipidos, glicosidos cianogenicos, y glucosinolatos (Chappel, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Bi ol. 198, 49: 311 - 343) . Los citocromos p450, tambien conocidos como proteinas hemotiolato p450, usualmente actuan como oxidasas terminales en cadenas multicomponentes de transferencia de electrones, llamados sistemas de monooxigenasa que contienen p450. Reacciones especificas catalizadas incluyen desmetilacion, hidroxilacion, epoxidacion, N-oxidacion, sulfooxidacion, N-, S-, y O-desalquilaciones, desulfatacion, desaminacion, y reduccion de grupos azo, nitro, y N-oxido.

El papel diverso de las enzimas p450 de la planta de Nicotiana ha sido implicado en la elaboracion de una variedad de metabolitos de la planta tales como fenilpropanoides, alcaloides, terpenoides, lipidos, glicosidos cianogenicos, glucosinolatos y un huesped de otras entidades quimicas. Durante los ultimos anos, se ha hecho evidente que algunas enzimas p450 pueden impactar la composicion de metabolitos vegetales en las plantas. Por ejemplo, se ha deseado durante mucho tiempo mejorar el sabor y el aroma de ciertas plantas por medio de la alteracion de su perfil de acidos grasos seleccionados a traves de fitomejoramiento; sin embarg o se sabe mu y poco acerca de lo s mecanismos involucrados en el control de los n iveles de estos constituyentes de la hoja. La reduccion de la expresion de enzimas p450 asociadas con la modificacion de acidos grasos puede facilitar la acumulacion de acidos grasos deseados que proporcionan cualidades fenotipicas mas preferidas de la h oja. La funcion de las enzimas p450 y su ampliacion de funciones en los constituyentes de la planta esta aun por descubrirse. Por ejemplo, se encontro una clase especial de enzimas p450 para catalizar el rompimiento del acido graso en aldehidos y alcoholes volatiles C6 y C9 que son los principales contribuyentes del olor a "verde fresco" de frutas y vegetales. El nivel de otras nuevas p450 objetivo puede ser alterado para mejorar las cualidades de los constituyentes de la hoja por medio de la modificacion de la composicion de los lipidos y metabolitos rotos relacionados en la hoja de Nicotiana. Varios de estos constituyentes en la h oja son afec tados por se nectud que estimula la maduracion de las propiedades de calidad de la hoja. Incluso otros reportes han mostrado que las enzimas p450 desempenan un papel funcional en la alteracion de acidos grasos que estan involucrados en interacciones planta-patogeno y de resistencia a enfermedades.

En otros casos, se ha sugerido que las enzimas p450 estan involucradas en biosintesis de alcaloides. La nornicotina es un alcaloide menor encontrado en Nicotiana tabaceum. Se ha postulado que es producida por la desmetilacion mediada por p450 de nicotina seguida por acilacion y nitrosacion en la posicion N produciendo asi una serie de Nacilnonicotinas y N-nitrosonornicotinas. Se piensa que la N-desmetilacion, catalizada por una desmetilasa putativa p450, es una fuente primaria de biosintesis de nornic otina en Nicotiana. Aunque se cree que la enzima e s microsomal, hasta el momento no se ha purificado exitosamente una enzima nicotina desmetilasa, ni se han aislado los genes involucrados.

Ademas, se h a formulado la hipotesis pero no se h a probado que la activida d de las enz imas p450 esta geneticamente controlada y tambien fuertemente influenciada por factores ambientales. Por ejemplo, se piensa que la desmetilacion de la nicotina en Nicotiana se incrementa sustancialmente cuando las plantas alcanzan una etapa madura. Ademas, se ha formula do la hipotesis aun no probada de que el gen para la desmetilasa contiene un elemento transponible que puede inhibir la traduccion del ARN cuando esta presente.

La gran multiplicidad de formas de la enzima p450, su estructura y funcion diferente ha hecho muy dificil la investigacion sobre enzimas p450 Nicotiana antes de la presente invencion. Ademas, la clonacion de enzimas p450 se ha visto obstaculizada al menos en parte debido a que estas proteinas localizadas en la membrana estan tipicamente presentes en baja cantidad y a menudo inestable para purificacion. Por lo tanto, existe la necesidad por la identificacion de enzimas p450 en plantas y las secuencias de acido nucleico asociadas con esas enzimas p450. En particular, unicamente se han reporta do una pocas proteinas citocromo p450 en Nicotiana. Las invenciones descritas aqui implican el descubrimiento de un nume ro sustancial de fragmentos de citocromo p450 que corresponden a diferentes grupos de especies de p450 con base en su identidad de secuencia.

Resumen La presente invencion esta dirigida a una molecula aislada de acido nucleico, a una planta transgenica de tabaco y a metodos que las involucran, como se describe en las reivindicaciones. La presente invencion esta dirigida ademas a enzimas p450 vegetales de Nicotiana. La presente invencion tambien esta dirigida a enzimas p450 en plantas cuya expresion es inducida p or etileno y/o s enectud de la pl anta. La p resente invencion esta i ncluso d irigida adicionalmente a secue ncias de acid o nucleico en plantas que tie nen actividad enzimatica, por ej emplo, siendo categorizadas como oxigenasa, desmetilasa y similares, u otras y el uso de aquellas secuencias para reducir o silenciar la expresion o sobreexpresion de estas enzimas. La invencion tambien se relaciona con enzimas p450 encontradas en plantas que contienen niveles mas altos de nornicotina que las plantas que exhiben niveles menores de nornicotina.

En un aspecto, la divulgacion esta dirigida a secuencias de acido nucleico como se expone en las SEQ. ID. Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313 y 315.

En un segu ndo aspecto rel acionado, aqu ellos fragm entos que conti enen un a ide ntidad ma yor al 75% en la secuencia de acid o n ucleico fuero n co locados e n g rupos dependiendo de su ide ntidad e n una reg ion correspondiente al primer acido nucleico despues del motivo GXRXCX (G/A) del citocromo p450 hasta el codon de detencion. Los grupos representativos de acido nucleico y las especies respectivas se muestran en la Tabla I.

En un tercer aspecto, la divulgacion esta dirigida a secuencias de aminoacidos como las expuestas en las SEQ. ID. Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314 y 316.

En un cuarto aspecto relacionado, aquellos fragmentos que contienen una identidad mayor al 71% en la secuencia de acido nucleico fueron colocados en grupos dependiendo de su identidad con respecto a los otros e n una region correspondiente al primer aminoacido seguido del motivo GXRXCX (G/A) del citocromo p450 hasta el codon de detencion. Los grupos representativos de aminoacidos... [Seguir leyendo]

1. Una molecula aislada de acido nucleico de Nicotiana en donde dicha molecula de acido nucleico comprende la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 356.

2. Una planta transgenica de tabaco, en donde dicha planta transgenica de tabaco comprende la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1.

3. La plata transgenica de tabaco de la reivindicacion 2, en donde dicha planta transgenica de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.

4. Un metodo para producir una planta transgenica de tabaco, en donde dicho metodo comprende las etapas de:

(i) enlazar operativamente la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 con un promotor funcional en dicha planta de tabaco para crear un vector de transformacion de la planta;

(ii) transformar dicha planta de tabaco con dicho vector para transformacion de la planta de la etapa (i) ;

(iii) seleccionar una celula vegetal transformada con dicho vector de transformacion; y (iv) regenerar una planta transgenica de tabaco a partir de dicha celula vegetal transformada.

5. El metodo de la reivindicacion 4, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion antisentido.

6. El metodo de la reivindicacion 4, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion sentido.

7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde dicha molecula de acido nucleico se expresa como una molecula de ARN bicatenario.

8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde dicha molecula de acido nucleico tiene aproximadamente de 15 a 25 nucleotidos de longitud.

9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde dicha planta transgenica de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.

10. Un metodo para seleccionar una planta de tabaco que contiene una molecula de acido nucleico, en donde dicha planta de tabaco se analiza por la presencia de la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 356.

11. El metodo para sel eccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 10, en don de dicha planta se analiza por hibridacion de ADN.

12. El metodo para seleccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 11, en donde dicha hibridacion de ADN es un analisis de transferencias tipo Southern.

13. El metodo para seleccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 11, en donde dicha hibridacion de ADN es un analisis de transferencias tipo Northern.

14. El metodo para sel eccionar una planta de tabaco de la reivindicacion 10, en donde dicha planta de tabaco se analiza por medio de deteccion por PCR.

15. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde dicha planta de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.

16. Un metodo para disminuir los niveles de nornicotina en una planta de tabaco, en donde dicho metodo comprende las etapas de:

(i) enlazar operativamente la molecula de acido nucleico de la reivindicacion 1 con un promotor fun cional en una planta de tabaco para crear un vector para transformacion de la planta;

(ii) transformar dicha planta de tabaco con dicho vector para transformacion de la planta de la etapa (i) ;

(iii) seleccionar una celula vegetal transformada con dicho vector de transformacion; y (iv) regenerar una planta transgenica de tabaco a partir de dicha celula vegetal transformada.

17. El metodo de la reivindicacion 16, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion antisentido.

18. El metodo de la reivindicacion 16, en donde dicha molecula de acido nucleico esta en orientacion sentido.

19. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde dicha molecula de acido nucleico se expresa como una molecula de ARN bicatenario.

20. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en donde dicha planta transgenica de tabaco es una planta de tabaco Nicotiana tabacum.

NOMBRE D89-AB1 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 149

NOMBRE D100-BE2 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 165

NOMBRE D120-AH4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 179

NOMBRE D209-AA10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 209

NOMBRE D215-AB5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 219

NOMBRE D222-BH14 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 235

NOMBRE D257-AE4 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 267

NOMBRE D138-AD12 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 285

NOMBRE D284-AH5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM SEQ. ID. NO. 295

El porcentaje de identidad entre la mayor parte de los pares relacionados se expresa en (0, 0 %) . Cada grupo tenía al menos 70% de identidad con otros miembros del grupo. El Grupo 19 contenía el porcentaje de identidad más bajo de 70, 0%.

FIG. 153

NOMBRE D425-AB10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 356

FIG. 154

NOMBRE D425-AB11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 358

FIG. 155

NOMBRE D425-AC9 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 360

FIG. 156

NOMBRE D425-AC10 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 362

FIG. 157

NOMBRE D425-AC11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 364

FIG. 158

NOMBRE D425-AG11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 366

FIG. 159

NOMBRE D425-AH7 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 368

FIG. 160

NOMBRE D425-AH11 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 370

FIG. 161

NOMBRE D427-AA5 ORGANISMO NICOTIANA TABACUM

SEQ ID 372