Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental con capacidad de diferenciarse en tejidos de las tres capas embrionarias,

endodermo, mesodermo y ectodermo.

Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental.

La presente invención está relacionada con células madre pluripotenciales obtenidas de la pulpa dental de pacientes de diferentes edades y su aplicación en la regeneración de tejidos.

Estado de la técnica

En los seres vivos, los tejidos sufren, a lo largo de la vida un desgaste, pero tienen capacidad de autorenovarse. De no existir esta renovación, se reduciría considerablemente la esperanza de vida de los seres vivos. En concreto son las células madre las que tienen esta capacidad de autorenovación de los tejidos. La capacidad de autorenovación se plasma, en la capacidad de producir más células madre y, por otro lado, de generar células de uno o más tipos celulares diferenciados.

El descenso replicativo de células madre implica la degeneración y muerte de los distintos tejidos, ya sea de manera aguda (infartos) o crónica (degeneración-envejecimiento).

Por la capacidad de autorenovación citada, actualmente se aplica la terapia celular con células madre, entre otras en: patologías cardíacas, patologías de la córnea, patologías del suelo pélvico. También se tratan fístulas especialmente en enfermos de Crohn.

Las células madre se pueden clasificar según su potencial de diferenciación en: totipotenciales, pluripotenciales y multipotenciales.

Las células madre totipotentes pueden crecer y formar un organismo completo, tanto los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darán lugar al saco vitelino), como los extraembrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los tipos celulares.

Las células madre multipotentes son aquellas que sólo pueden generar células de su propia capa o linaje embrionario de origen (por ejemplo: una célula madre mesenquimal de médula ósea, al tener naturaleza mesodérmica, dará origen a células de esa capa como miocitos, adipocitos u osteocitos, entre otras).

Las células madre pluripotenciales no pueden formar un organismo completo, pero pueden diferenciarse en células provenientes de los tres linajes embrionarios: (a) ectodermo, que es el origen del sistema nervioso, el sistema respiratorio, tubo digestivo superior (estomodeo), la epidermis y sus anexos (pelo y uñas) y las glándulas mamarias; (b) endodermo, que es el origen del intestino, el hígado, el páncreas, los pulmones y la mayor parte de los órganos internos; (c) y mesodermo, que es el origen del sistema esquelético, los músculos, y los sistemas circulatorio y reproductor. Igualmente, pueden formar cualquier otro tipo de célula proveniente del germinal y el saco vitelino.

El hecho de que las células pluripotenciales tengan la capacidad de diferenciarse en un número tan elevado de tejidos, las hace de especial interés para el diseño de nuevas terapias, en general, y de terapias regenerativas, en particular.

Actualmente, las células madre pluripotenciales en individuos adultos se obtienen principalmente de médula ósea.

Es bien conocido en el estado de la técnica, que cuando se lleva a cabo el aislamiento y caracterización de las células madre pluripotenciales a partir de la muestra de médula ósea extraída, existen diferentes criterios bien establecidos en el estado de la técnica que permiten clasificar de manera clara a una célula madre como célula pluripotencial.

Un primer criterio sería determinar la capacidad de diferenciación de la célula aislada a tejidos que proceden de las tres capas embrionarias (endodermo, ectodermo y mesodermo) usando medios de diferenciación disponibles comercialmente, (cfr. Prelle et al., "Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species, present status and future prospects", Cell Tissues Organs, 1999, vol 165, pág. 220-236).

Un segundo criterio consistiría en identificar los marcadores que expresa la célula madre aislada.

Por ejemplo la expresión del gen OCT3/4 ha sido descrita como necesaria para que una célula madre sea pluripotencial (cfr. Niwa et al. "Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells", Nature, 2000 vol. 24, pág. 372-376). La expresión de SSEA4 en células pluripotenciales ha sido descrita en (cfr. Venable et al. "Lectin binding profiles of SSEA-4 enriched, pluripotent human embryonic stem cell surfaces" BMC Dev Biol. 2005, vol 21, pág. 5-15), y la expresión de CD13 igualmente en células pluriputentes se cita en (cfr. Young et al., "Human pluripotent and progenitor cells display cell surface cluster differentiation markers cd10, cd13, cd56, and mhc class-I", Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1999 vol. 221, nº 1, pp. 63-7).

Jiang y colaboradores (cfr. Jiang et al., "Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow", Nature, 2002, vol 418, pág. 41-47), han descrito la caracterización de células madre pluripotenciales en una población celular de la médula ósea. Esta población son las denominadas MAPC (Células progenitoras multipotenciales adultas). En este artículo se indica que las MAPCs expresan niveles altos de CD13, SSEA-4 y OCT3/4, marcadores propios de células pluripotenciales. Al igual que las células madre embrionarias, en las MAPCs se detecta la activación de los factores de transcripción OCT-4, NANOG y REX-1, factores que son necesarios para mantener la célula en un estado proliferativo e indiferenciado.

Adicionalmente, se incluyen ensayos de clonación que demuestran que es una única célula la que es capaz de diferenciarse a tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias (endodermo, mesodermo o ectodermo). A diferencia de las células de la invención, estas células no expresan el gen CD105 y sí expresan el gen CD44 y CD73. El origen de estas células es mesodérmico, mientras que el origen de las células de la invención es ectodérmico.

La fuente de células madre pluripotenciales que describe este artículo es la médula ósea. En las extracciones de células madre de médula ósea es necesario una anestesia general o local. El método que se emplea para obtenerlas es el aspirado del contenido medular mediante la punción de un hueso. El material que se obtiene pasa por una serie de procesos de cribado para separar las células. Todo esto hace que la obtención de estas células sea un proceso complejo y poco eficiente.

Por todo lo anterior existe la necesidad de encontrar fuentes alternativas a partir de las cuales se puedan extraer células madre pluripotenciales.

Explicación de la invención

Los investigadores de la presente invención han descubierto que la pulpa dental es una fuente de células madre pluripotenciales. Ventajosamente, las células de la invención están siempre presentes en los humanos, independientemente de la edad de los mismos, aunque la proporción disminuya. Tal y como se ilustra más abajo, las células madre obtenidas a partir de este tejido expresan preferiblemente los marcadores CD13, SSEA4 OCT3/4 y CD105, lo cual indica que dichas células son de tipo pluripotencial.

Además se ha comprobado que las células madre pluripotenciales aisladas a partir de pulpa dental tienen la capacidad de diferenciarse a tejidos procedentes de cada una de las tres capas embrionarias. Esto las hace de interés en el campo de la cirugía, y en particular en el campo de la reconstrucción de tejidos, tales como óseo, neuronal y hepático.

Así, la presente invención se refiere en un primer aspecto a una célula madre pluripotente caracterizada porque se obtiene a partir de la pulpa dental y expresa al menos los genes NANOG, SOX2, y expresa los marcadores SSEA4, OCT3/4 y CD105.

Entre las características ventajosas de las células de la invención es que la fuente de donde provienen, la pulpa dental, es de fácil extracción sin acarrear los problemas de extracción que presentan las células de la médula ósea.

La células de la invención tienen un tamaño pequeño entre 5 y 8 micras. Además no presentan anomalías de cromosomas o cambios estructurales durante el cultivo, elemento muy importante para su aplicación como terapia celular para la regeneración de tejidos.

Por otro lado, las células de la invención son células madre pluripotenciales adultas. Que sean adultas es de especial importancia ya que se evita el rechazo... [Seguir leyendo]

1. Célula madre pluripotente que tiene la identificación de referencia "Human dental pulp pluripotent stem cells (hDPPSC)" en la institución DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GmbH con nº de acceso DSM ACC3002.

2. Cultivo de una célula madre según la reivindicación 1 en un medio capaz de soportar la proliferación de dichas células, dicho medio incluyendo al menos un factor de transcripción.

3. Cultivo según reivindicación 2 caracterizado porque el medio comprende al menos los factores de crecimiento EGF y PDGF, y al menos el factor de transcripción LIF.

4. Método para obtener células madre pluripotenciales de acuerdo con cualquiera la reivindicación 1, que comprende los pasos de: (a) disgregación del tejido de la pulpa dental aislada de un ser mamífero; y (b) separación de las células madre del tejido disgregado resultante de la etapa (a) c) cultivo de las células en un medio que presente al menos un factor de transcripción.

5. Composición terapéutica que comprende una célula madre pluripotente según se definen en la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable, dicha célula estando presente en una cantidad efectiva para producir células de tejidos.

6. Composición terapéutica según reivindicación 5 para producir células del tejido óseo.

7. Composición terapéutica según reivindicación 5 para producir células del tejido neuronal.

8. Composición terapéutica según reivindicación 5 para producir células del tejido hepático.

9. Uso de una célula pluripotencial según se define en la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento destinado a la regeneración, reparación de tejidos o transplante de tejidos en mamíferos.

10. Uso según reivindicación 9, para la regeneración de tejido óseo.

11. Uso según reivindicación 9, para la regeneración de tejido neuronal.

12. Uso según la reivindicación 9, para la regeneración de tejido hepático.