Aparato para el diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica de la patología trombótica-isquémica yhemorrágica del aparato cardiovascular,

caracterizado porque comprende:

- una pluralidad de elementos tubulares (11) conectados de forma fluida para conseguir un circuito cerrado(26) en el que una muestra de sangre es capaz de fluir;

- medio de bombeo (13) del tipo pulsátil capaz de bombear la sangre en dicho circuito cerrado (26) encondiciones fluidodinámicas controladas y variables;

- al menos una cámara de perfusión (12), que comprende un cartucho de perfusión de canales múltiples(22) formado por una pluralidad de microcanales (23) en conexión fluida con dicho circuito cerrado (26) y enla que la sangre puede fluir, siendo capaces dichos microcanales (23) de simular condicionesfluidodinámicas de la sangre análogas a las condiciones fluidodinámicas de la sangre que fluye en elcuerpo humano de modo que se puedan reproducir fenómenos y procesos de hemostasia, determinandodicho circuito (26) y cámara de perfusión (12) en su conjunto un sistema hidráulicamente cerrado durante elprocedimiento analítico;

- medio de adquisición óptica (33), adecuado para adquirir, por medio de una detección continua y entiempo real, datos a alta frecuencia de la sangre que circula en los microcanales (23) de dicho cartucho(22);

- medio de procesamiento electrónico (17, 18) adecuado para procesar al menos dichos datos adquiridospor dicho medio de adquisición óptica (33), para efectuar selectivamente dicho diagnóstico, pronóstico ysupervisión farmacológica.

Aparato y procedimiento para el diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica de la patología trombóticaisquémica y hemorrágica del aparato cardiovascular

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un aparato y procedimiento para el diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica de la patología trombótica-isquémica y hemorrágica del aparato cardiovascular. Para ser más exactos, la presente invención permite el estudio in vitro, en un circuito cerrado, de hemostasia primaria y la formación del coágulo.

Antecedentes de la invención

La hemostasia es el proceso que conduce a la detención de pérdida de sangre de vasos sanguíneos dañados y es esencial para la vida. Puede dividirse en tres procesos principales:

- adhesión y activación de las plaquetas;

- formación de fibrina;

- contracción vascular.

La trombosis es una formación no deseada de un bloqueo hemostático o un trombo dentro de un vaso sanguíneo o del corazón.

Un acontecimiento hemostático patológico, bien trombótico, debido a la falta repentina de flujo sanguíneo en un vaso sanguíneo, como sucede con arterias coronarias en infarto de miocardio, o bien hemorrágico, representa un grave problema para el sistema cardiovascular. Por otro lado, una de las manifestaciones de enfermedad más frecuentes en el “mundo Occidental” se asocia sin duda alguna con alteraciones cardiovasculares adquiridas tales como manifestaciones ateroscleróticas, aneurismas, derivaciones aterovenosas, vasculitis, anomalías de las válvulas cardiacas, fibrilaciones auriculares y enfermedades de conducción, trombosis de las venas y arterias y numerosas anomalías genéticas asociadas con defectos hemostáticos. Estas manifestaciones patológicas pueden estar presentes incluso en sujetos que en su vida diaria normal no han mostrado nunca ningún acontecimiento patológico y que, por el contrario, con ocasión de operaciones quirúrgicas, pueden sufrir manifestaciones hemorrágicas graves. Se reconoce que la enfermedad cardiovascular representa la causa de muerte del 39% de los hombres y 49% de las mujeres (Ital Heart J 2004; 5 (Supl 3) : 22S-37S) .

En la última década el número de anomalías genéticas halladas en estos defectos hereditarios o adquiridos ha aumentado drásticamente.

En muchos casos, sin embargo, la identificación de las anomalías genéticas no conduce a la conclusión de que ese paciente particular tendrá sin duda alguna una manifestación patológica, al igual que por otro lado los sujetos con manifestaciones trombóticas o hemorrágicas no siempre tienen una anomalía genética manifiesta.

Esta situación, claramente difícil desde un punto de vista de diagnóstico y pronóstico, se debe al hecho de que el sistema hemostático, que controla principalmente el estado de reparación de tejido, se caracteriza por una combinación multifactorial de acciones bioquímicas-biofísicas para controlar y regular el proceso, con una abundancia de “mecanismos redundantes”, también capaces de compensar posibles deficiencias no graves.

Esto hace extremadamente importante tener, en el ambiente clínico, un ensayo funcional ex vivo que pueda identificar riesgos trombóticos y hemorrágicos potenciales en sujetos “silenciosos” para manifestaciones cardiovasculares patológicas.

Como se conoce, las plaquetas son los principales protagonistas celulares de procesos hemostáticos y con sus capacidades adhesivas y de agregación intrínsecas normalmente controlan la reparación de daño tisular, que deriva de acontecimientos fisiológicos o que siguen a lesiones patológicas.

En particular, las interacciones entre plaquetas y el endotelio basal son importantes.

En un vaso sanguíneo no dañado normal el endotelio realiza un papel activo en la prevención de la formación del trombo. De hecho, el endotelio genera y libera no solamente prostaciclina y nitróxido, que inhiben la agregación de plaquetas, sino también el activador de plasminógeno y sustancias anticoagulantes tales como heparina y heparin sulfato.

Cuando una placa aterosclerótica se rompe o un vaso sanguíneo se corta o se daña, el endotelio se daña y las plaquetas se adhieren a las sustancias que componen el subendotelio, por ejemplo colágeno, y se activan.

Esta adhesión implica la interacción entre los componentes subendoteliales como el factor de Von Willerbrand, y el complejo de receptor glicoproteico GPIb-IX-V localizado en la membrana superficial de las plaquetas.

La activación de las plaquetas conduce a su cambio de forma, a medida que se aplanan y se forman seudópodos.

La masa de plaquetas agregadas forma un tapón que, junto con la constricción de los vasos mantiene la hemostasia en los vasos pequeños hasta que el tapón de plaqueta se refuerza por la fibrina.

Sin embargo, en algunas condiciones, las plaquetas pueden exacerbar el proceso de reparación y se activan de una manera inapropiada si hay un cambio patológico en los vasos sanguíneos, por ejemplo aterosclerosis que puede provocar un acontecimiento drástico que conduce a la oclusión del vaso sanguíneo: trombosis. Este último acontecimiento, si se produce en distritos “nobles” tales como la circulación del cerebro o corazón, pueden tener consecuencias letales.

Para entender los mecanismos que conducen a la formación y crecimiento de un “trombo mural” oclusivo es necesario definir las propiedades, que son variables, del flujo sanguíneo y la pared vascular del flujo sanguíneo y la pared vascular. Estas variables, como la naturaleza de las superficies reactivas, células sanguíneas y pared vascular y las fuerzas hidrodinámicas, pueden modular directamente el proceso de adhesión, activación, agregación y crecimiento de los trombos plaquetarios.

La fase primaria de la “cascada trombótica” implica que las plaquetas, primero en movimiento con el flujo sanguíneo, se unen de forma irreversible, adhesión estable, hasta el punto de daño vascular, resistiendo la acción contraria de las fuerzas hidrodinámicas que tienden a devolverlas al fluido (Bell GI, Science. 1978; 200 (4342) : 618-27) .

Las fuerzas hidrodinámicas que se oponen a la adhesión aumentan a medida que aumentan las tasas de cizallamiento, y se contrastan eficazmente por la acción de la sustancia citoadhesiva Factor de Von Willerbrand (vWF) (Savage, B y col. 1996; Cell 84: 289-297) . Debido a sus propias propiedades intrínsecas el vWF es capaz de cambiar el estado conformacional una vez unido al colágeno, la sustancia básica de la matriz extracelular, y sometido a altas tasas de cizallamiento. De hecho, en estas condiciones el vWF pasa de una forma globular, propia de su estado en solución en la sangre, a la forma elongada, caracterizada por un aumento fundamental de los sitios de adhesión disponibles para las plaquetas (Siedlecky CA. y col. Blood. 1996; 88 (8) : 2939-50) . El vWF aumenta por lo tanto su capacidad adhesiva con el aumento de intensidad del flujo; esta peculiaridad, asociada con la capacidad del colágeno para unirse a las plaquetas a flujo bajo, provoca que la asociación wWF-colágeno represente un mecanismo de adhesión dinámica para las plaquetas, capaz de adaptarse a cualquier condición de fluidodinámica, de la vena o arteria, fisiológica en la preparación del daño tisular o patológica tal como por ejemplo en la rotura de la placa aterosclerótica (Kher N. y col. Semin Thromb Hemost. 2004; 30 (6) : 665-72) . Otras sustancias, como los proteoglicanos, fibronectina, fibrinógeno, y otras sustancias que derivan de las células endoteliales, concurren para mejorar la eficacia de este modelo adhesivo, adaptándose a los diversos distritos vasculares y las diferentes estimulaciones capaces de iniciar el proceso hemostático (Ruggeri ZM. J Thromb Hemost. 2003; 1 (7) : 1335-42) .

También se sabe que una hemorragia o trombosis puede permanecer fácilmente sin diagnosticar con el uso de sistemas analíticos tradicionales, tales como la evaluación del tiempo de hemorragia, turbidimetría, agregación de plaquetas potenciométrica, en luminiscencia u otros.

En el campo de diagnóstico de las patologías hemostáticas, se conocen en particular tres aparatos, que se ilustrarán ahora brevemente (Harrison P. Blood Reviews. 2005; 19: 111-123) .... [Seguir leyendo]

1. Aparato para el diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica de la patología trombótica-isquémica y hemorrágica del aparato cardiovascular, caracterizado porque comprende:

- una pluralidad de elementos tubulares (11) conectados de forma fluida para conseguir un circuito cerrado

(26) en el que una muestra de sangre es capaz de fluir;

- medio de bombeo (13) del tipo pulsátil capaz de bombear la sangre en dicho circuito cerrado (26) en condiciones fluidodinámicas controladas y variables;

- al menos una cámara de perfusión (12) , que comprende un cartucho de perfusión de canales múltiples

(22) formado por una pluralidad de microcanales (23) en conexión fluida con dicho circuito cerrado (26) y en la que la sangre puede fluir, siendo capaces dichos microcanales (23) de simular condiciones fluidodinámicas de la sangre análogas a las condiciones fluidodinámicas de la sangre que fluye en el cuerpo humano de modo que se puedan reproducir fenómenos y procesos de hemostasia, determinando dicho circuito (26) y cámara de perfusión (12) en su conjunto un sistema hidráulicamente cerrado durante el procedimiento analítico;

- medio de adquisición óptica (33) , adecuado para adquirir, por medio de una detección continua y en tiempo real, datos a alta frecuencia de la sangre que circula en los microcanales (23) de dicho cartucho (22) ;

- medio de procesamiento electrónico (17, 18) adecuado para procesar al menos dichos datos adquiridos por dicho medio de adquisición óptica (33) , para efectuar selectivamente dicho diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica.

2. Aparato como en la reivindicación 1, caracterizado porque los microcanales (23) son capilares que tienen un diámetro comprendido entre 50 y 100 micrómetros.

3. Aparato como en la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque los microcanales (23) son alimentados por un tubo común (37) , relativamente anchos con respecto a la entrada de los microcanales (23) para garantizar la distribución uniforme del fluido y reducir las condiciones de flujo perturbado dentro de dichos microcanales (23) .

4. Aparato como en la reivindicación 1, 2 o 3 caracterizado porque dichos microcanales (23) se disponen paralelos entre sí.

5. Aparato como en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque dicho medio de adquisición óptica (33) comprende un microscopio (14) conectado en serie con un dispositivo de adquisición de vídeo (15) .

6. Aparato como en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque comprende medio de registro (16) adecuado para registrar dichos datos adquiridos por dicho medio de adquisición óptica (33) y para poner dichos datos registrados a disposición de dicho medio de procesamiento electrónico (17, 18) .

7. Aparato como en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque dicho medio de bombeo (13) del tipo pulsátil comprende un bomba pulsátil (19, 20) capaz de reproducir un flujo pulsátil análogo al flujo pulsátil del corazón humano.

8. Aparato como cualquier reivindicación anterior, caracterizada por que comprende medio de medición de la presión (21) capaz de detectar datos de presión al menos en dicho tubo (23) de dicha cámara de perfusión (12) , y capaz de enviar dichos datos de presión a dicho medio de procesamiento electrónico (17, 18) de modo que puedan analizarse y procesarse.

9. Aparato como en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque dichos microcanales (23) están fabricados de un material polimérico.

10. Aparato como en la reivindicación 9, caracterizado porque dicho material polimérico es un material plástico y se selecciona de un grupo que comprende: policarbonato, copolímeros cíclicos con una base de olefina y polímeros cíclicos con una base de olefina.

11. Aparato como en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque, dentro de los microcanales (23) de dicho cartucho (22) , está proporcionada una sustancia de sustrato citoadhesivo que es capaz de simular una superficie de vaso dañada.

12. Aparato como en la reivindicación 11, caracterizado porque dicha sustancia de sustrato citoadhesivo está comprendida en dicho tubo (23) .

13. Aparato como en la reivindicación 11 o 12, caracterizado porque dicha sustancia de sustrato citoadhesivo está seleccionada de un grupo que comprende:

- sustancias en el grupo A que comprenden sustancias de sustrato que conducen a la adhesión, activación, agregación y formación del trombo plaquetario con altas tasas de cizallamiento, como las halladas en arterias y capilares incluyendo el vWF;

- sustancias en el grupo B que comprenden sustancias de sustrato que actúan a tasas de cizallamiento bajas, como las halladas en venas, fibrinógeno, colágenos;

- sustancias en el grupo C que comprenden sustancias de sustrato que soportan la adhesión de plaquetas pero no activación y agregación y solamente a tasas de cizallamiento bajas, fibronectina, PGM/versicanos y perlecan;

- sustancias en el grupo D que comprenden sustancias de sustrato que potencian la actividad protombótica de otras moléculas, efectos aditivos a tasas de cizallamiento altas y/o bajas, tales como ciertos proteoglicanos, fibulinas implicadas en la adhesión de plaquetas y fibrinógeno;

- sustancias en el grupo E que comprenden sustancias de sustrato que actúan como sustancias antitrombóticas a diversas tasas de cizallamiento, tales como diversos proteoglicanos, ácido hialurónico y ciertas glicoproteínas.

14. Procedimiento para el diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica de la patología trombótica-isquémica y hemorrágica del aparato cardiovascular, caracterizado porque comprende las etapas de:

- poner a disposición un circuito cerrado (26) , en el que una muestra de sangre puede fluir;

- poner a disposición medio de bombeo (13) del tipo pulsátil, capaz de bombear la sangre en dicho circuito;

- poner a disposición una cámara de perfusión (12) , que comprende un cartucho de perfusión de canales múltiples (22) formada por una pluralidad de microcanales (23) en conexión fluida con dicho circuito cerrado (26) , siendo capaces dichos microcanales (23) de simular condiciones fluidodinámicas de la sangre análogas a las condiciones fluidodinámicas de la sangre que fluye en el cuerpo humano y para simular la hemodinámica de la sangre humana, determinando dicho circuito (26) y cámara de perfusión (12) en su conjunto un sistema hidráulicamente cerrado durante el procedimiento analítico;

- hacer a la sangre fluir dentro de dicho circuito cerrado (26) por medio de dicho medio de bombeo (13) del tipo pulsátil;

- supervisar, por medio de una detección continua y en tiempo real de datos a alta frecuencia en la sangre que circulan los microcanales (23) de dicho cartucho (22) , el desarrollo del flujo de sangre al menos en los microcanales (23) de dicho cartucho (22) para efectuar selectivamente dicho diagnóstico, pronóstico y supervisión farmacológica de la patología trombótica-isquémica y hemorrágica del aparato cardiovascular.

15. Procedimiento como en la reivindicación 14, caracterizado porque comprende las etapas de:

- poner a disposición el medio de adquisición óptico (14) , adecuado para adquirir datos sobre el flujo de sangre que circula al menos en los microcanales (23) del cartucho (22) ;

- poner a disposición medio de procesamiento electrónico (17, 18) , adecuado para recibir dichos datos adquiridos por dicho medio de adquisición óptica (14) ;

- efectuar dicha etapa de supervisión por medio de dicho medio de adquisición óptica (14) y dicho medio de procesamiento electrónico (17, 18) .