Anticuerpo que presenta afinidad específica por un sitio determinante antigénico producido por la reacción de la enzima de escisión del VWF ADAMTS13 con el factor de Von Willebrand (VWF) o con un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias,

pero que no presenta afinidad específica por el VWF o la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias, en el que el sitio determinante antigénico es un péptido que comprende en su extremo C la secuencia de aminoácidos: Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr.

Anticuerpo para el análisis de la actividad de la ADAMTS13 y método de análisis de la actividad.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo, en particular a un anticuerpo monoclonal, que presenta reactividad (afinidad) específica por un sitio determinante antigénico producido por la reacción de una enzima que escinde el factor de Von Willebrand (a la que se hace referencia en adelante como "ADAMTS13") con el factor (al que se hace referencia en adelante a veces como "VWF") o con un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias, pero que no presenta una reactividad específica al VWF o al péptido sin la influencia proporcionada por la ADAMTS13; a un método para producirlo; y al uso del mismo.

La presente solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes japonesas de patente nº 2005-036612 y 2005-157530.

Antecedentes de la técnica

La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) es un síndrome caracterizado, por ejemplo, por trombocitopenia, anemia hemolítica y disfunción neurológica grave. En el pasado era una enfermedad de diagnóstico desfavorable con una tasa de mortalidad próxima al 80% entre los pacientes en los 3 meses siguientes al diagnóstico. Sin embargo, el diagnóstico ha mejorado considerablemente en la actualidad gracias al intercambio de plasma.

Recientemente se ha publicado que la PTT podría atribuirse a un descenso en la actividad de la enzima de escisión del VWF (ADAMTS13) . En concreto, se ha descubierto la presencia de un inhibidor de tipo IgG contra la enzima de escisión del VWF que disminuye la actividad de dicha enzima, provocando la PTT adquirida (documentos no de patente nº 1 y 2) . Además, se ha demostrado que el síndrome de Upshaw-Schulman (SUS) , una PTT congénita, se caracteriza por una deficiencia genética de la enzima de escisión del VWF (documento no patentado nº 3) . Se ha demostrado que el gen que codifica esta enzima de escisión del VWF es el ADAMTS13 (documentos no de patente nº 4 y 5) .

La enzima ADAMTS13 es una metaloproteasa de cinc que escinde la subunidad del VWF específicamente en la unión Tyr842-Met843. La actividad de esta enzima se mide mediante un análisis de multímeros del VWF en el que este factor se utiliza como sustrato para detectar los fragmentos derivados del mismo mediante una electroforesis. Este método presenta la ventaja de permitir una medición exacta de la actividad de la ADAMTS13, pero resulta complicado de ejecutar, de ahí que sea deseable desarrollar un método de medición que, sobre todo, sea más sencillo.

Los documentos no de patente nº 6 a 8 informan de un método en el que el dominio A2 del VWF o una fracción del mismo se usa como sustrato para la ADAMTS13 con el fin de medir la actividad de esta última. No son sustratos naturales, sino que se expresan en E. coli por recombinación genética. Dado que estos sustratos son degradados por la ADAMTS13 presente en muestras de plasma, los métodos de medición descritos anteriormente detectan estos sustratos por su peso molecular mediante electroforesis y transferencia Western, y después hacen reaccionar dichos sustratos con la enzima para medir inmunológicamente los sustratos restantes no degradados, para así detectar y determinar la actividad de la ADAMTS13. Sin embargo, como estos métodos usan una correlación inversa entre la actividad de la ADAMTS13 y la intensidad observada de la señal, y su curva estándar adopta un gradiente negativo, no son capaces de proporcionar reproducibilidades y sensibilidades adecuadas en la región clínicamente importante del 5% o inferior, lo cual supone un problema todavía sin resolver.

Con el propósito de abordarlo, se ha publicado un método para medir la actividad de la ADAMTS13 del plasma mediante un sustrato fluorescente extinguible (documento no de patente nº 9) . Este método contiene una curva estándar que cubre un gradiente positivo donde la intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que la actividad de la ADAMTS13 aumenta. Sin embargo, el método presenta un problema para su uso en un laboratorio clínico general: requiere un costoso sustrato sintetizado químicamente de manera especial para efectuar un ensayo de frecuencia con un fluorómetro. El documento WO 2005/008241 A1 se refiere a métodos y sistemas para la detección de multímeros del VWF. El documento WO 2005/008241 A1 describe anticuerpos dirigidos contra el factor VWF entero.

[Documento no de patente nº 1] New Engl. J. Med. 339, 1578-1584, 1998 [Documento no de patente nº 2] New Engl. J. Med. 339, 1585-1594, 1988 [Documento no de patente nº 3] J. Hematol. 74, 101-108, 2001 [Documento no de patente nº 4] J. Biochem. 130, 475-480, 2001 [Documento no de patente nº 5] J. Biol. Chem. 276, 41059-41063, 2001 [Documento no de patente nº 6] Blood, 103, 607-612, 2004 [Documento no de patente nº 7] J. Thromb. Haemost. 2, 485-491, 2004 [Documento no de patente nº 8] Thromb Haemost. 91, 806-811, 2004 [Documento no de patente nº 9] The Journal of Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis, 15, 421, 2004

Descripción de la invención

(Problemas que deben resolverse)

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un anticuerpo útil para medir la actividad de la ADAMTS13. Más específicamente, el objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un anticuerpo con afinidad por un péptido producido por la hidrólisis del factor VWF con la enzima ADAMST13, pues dicho factor es un sustrato de dicha enzima, o el péptido parcial del VWF, que puede servir de sustrato de esa misma enzima, así como un uso del anticuerpo de interés y el anticuerpo de interés en forma de anticuerpo monoclonal. Además, otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una línea celular de hibridoma que produzca el anticuerpo monoclonal de interés.

(Medios para resolver los problemas)

Los inventores de la presente invención estudiaron detalladamente la forma de encontrar un método para medir la actividad de la ADAMTS13 y, fruto de ello, lograron que un péptido, cuyo lado del extremo C contiene una secuencia de aminoácidos situada hacia el lado del extremo N en relación con un sitio de escisión específico que la ADAMTS13 reconoce en el VWF o en el péptido parcial del mismo que puede ser usado como sustrato, fuera usado como antígeno para producir un anticuerpo monoclonal que podía reconocer específicamente un sitio determinante antigénico producido por la escisión del sustrato con la ADAMTS13, estableciendo a partir de ahí una línea celular de hibridoma productora del anticuerpo monoclonal de interés y hallando además un uso para este anticuerpo monoclonal de interés.

En resumen, la presente invención se compone de lo siguiente:

1. Un anticuerpo que presenta reactividad (afinidad) específica hacia un sitio determinante antigénico producido por la reacción de la enzima de escisión del VWF ADAMTS13 con el factor de Von Willebrand (VWF) o un péptido con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias, pero que no presenta reactividad específica frente al VWF o la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias, donde el determinante antigénico es un péptido que comprende en su extremo C la secuencia de aminoácidos: Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr.

2. El anticuerpo según el aspecto 1 anterior, donde el determinante antigénico producido por la reacción de la ADAMTS13 con el VWF o con el péptido con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias es un sitio determinante antigénico producido por la escisión del VWF

o del péptido con la ADAMTS13.

3. El anticuerpo según los aspectos 1 o 2 anteriores, donde el determinante antigénico está presente en un nuevo fragmento de péptido hacia el extremo N de un sitio de escisión producido por la escisión del VWF o del péptido con la ADAMTS13.

4. El anticuerpo según cualquiera de los aspectos 1 a 3 anteriores, donde el anticuerpo presenta reactividad al péptido representado por la SEC ID nº 2 proporcionada en el listado de secuencias.

5. El anticuerpo según cualquiera de los aspectos 1 a 4 anteriores, donde el anticuerpo presenta reactividad a un dominio que comprende por lo menos 4 residuos de aminoácidos del extremo C del péptido representado por la SEC ID nº 2 del listado de secuencias.

6. El anticuerpo según cualquiera de los aspectos 1 a 5 anteriores,... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo que presenta afinidad específica por un sitio determinante antigénico producido por la reacción de la enzima de escisión del VWF ADAMTS13 con el factor de Von Willebrand (VWF) o con un péptido que presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias, pero que no presenta afinidad específica por el VWF o la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias, en el que el sitio determinante antigénico es un péptido que comprende en su extremo C la secuencia de aminoácidos: Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo presenta afinidad por el péptido representado por la SEC ID nº 2 proporcionada en el listado de secuencias.

3. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo presenta afinidad por el péptido representado por la SEC ID nº 2 proporcionado en el listado de secuencias, pero no presenta afinidad por ninguno de los péptidos representados por las SEC ID nº 3 a 8 proporcionadas en el listado de secuencias.

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la afinidad por el péptido representado por la SEC ID nº 2 proporcionada en el listado de secuencias es por lo menos cinco veces más fuerte que la afinidad por el VWF purificado de plasma humano.

5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la afinidad por el péptido representado por la SEC ID nº 2 proporcionada en el listado de secuencias es por lo menos tres veces más fuerte que la afinidad por un péptido que presenta la secuencia representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias.

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la afinidad por el péptido representado por la SEC ID nº 2 proporcionada en el listado de secuencias es por lo menos cinco veces más fuerte que la afinidad por el péptido representado por la SEC ID nº 8 proporcionada en el listado de secuencias.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma que presenta el número de registro FERM BP-10479 o FERM BP-10480.

9. Hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal según la reivindicación 7.

10. Hibridoma según la reivindicación 9, en el que el hibridoma presenta el número de registro FERM BP-10479 o FERM BP-10480.

11. Método para medir la actividad de la ADAMTS13, que comprende las etapas que consisten en:

- hacer reaccionar

(i) un péptido sustrato escindible por la ADAMTS13;

(ii) un péptido que presenta la secuencia representada por la SEC ID nº 1 proporcionada en el listado de secuencias; o

(iii) el VWF

con una muestra que se va a analizar para la actividad de la ADAMTS13, y

- hacer reaccionar el producto de reacción de la etapa anterior con por lo menos un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. Método para medir la actividad de la ADAMTS13 de una muestra según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo está marcado con un material de marcado.

13. Método para medir la actividad de la ADAMTS13 de una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en el que el anticuerpo es inmovilizado sobre un soporte sólido.

14. Método para medir la actividad de la ADAMTS13 en una muestra según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el anticuerpo es soportado sobre una partícula insoluble en agua.

15. Método para examinar la enfermedad microangiopática por el método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.

16. Reactivo o kit que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.