Anticuerpo contra ephrin B2 y su uso.

La presente invención se refiere a un nuevo anticuerpo contra ephrin B2 y a su uso para detectar dicha proteína y como medicamento para inhibir la angiogénesis y la linfoangiogénesis,

en el tratamiento de enfermedades en las que estos procesos están implicados como, por ejemplo, el cáncer.

Anticuerpo contra ephrin 82 y su uso La presente invención pertenece al campo de la Biotecnologfa y la Biomedicina, y se refiere a un nuevo anticuerpo específico contra ephrin B2, capaz de bloquear la formación de vasos sangufneos (angiogenesis) y linfaticos (linfoangiogenesis) . Ademas, la presente invención se refiere al uso de dicho anticuerpo, por ejemplo, para la preparación de un medicamento.

ESTADO DE LA TECNICA

La angiogenesis o formación de vasos sangufneos nuevos a partir de preexistentes desempena un papel fundamental en numerosos procesos fisiológicos durante el desarrollo embrionario y en la vida postnatal: reproducción, cicatrización e inflamación. Aunque los mecanismos moleculares responsables de la transición de una celula endotelial hacia un fenotipo angiogenico no son completamente conocidos, se trata de un proceso complejo que implica la proliferación, migración y ensamblaje de celulas endoteliales, seguido por el reclutamiento de otras celulas perivasculares como pericitos o celulas musculares y de la remodelación de la matriz extracelular (Risau, W.

Nature 1997; 386:671-674) . El crecimiento incontrolado de los vasos sangufneos es un trastorno subyacente en numerosas patologfas como artritis reumatoide o retinopatfa diabetica y, sobre todo en procesos neoplasicos. El crecimiento tumoral va a depender del constante aporte de oxígeno y nutrientes a traves de la constitución de una red de nuevos vasos sangufneos, de tal

manera que en ausencia de la vascularización adecuada, las celulas sufren un proceso de necrosis y/o apoptosis que inhibe o modera el incremento del volumen tumoral. Ademas de vasos sangufneos, el sistema circulatorio de los vertebrados esta

constituido por vasos linfaticos que tambien juegan un papel crftico durante el desarrollo del organismo y en procesos patológicos. El sistema linfatico drena el lfquido intersticial de los tejidos y lo reincorpora al sistema sangufneo;

ademas, absorbe lfpidos del sistema digestivo, forma parte de la defensa inmune del individuo transportando celulas del sistema inmune, por ejemplo en inflamación, y en condiciones patológicas induce diferentes tipos de linfedema, enfermedades inflamatorias y participa en la invasión y metastasis de carcinomas (Tammela, T. y Alitalo, K. Cell 2010; 140:460-76) . El estudio de la linfangiogenesis o formación de vasos linfaticos a partir de preexistentes permaneci6 postergado durante muchas decadas y no es hasta los ultimos anos cuando se han descrito mecanismos biomoleculares y marcadores específicos, los cuales se estan utilizando actualmente para estudiar el proceso de diseminación tumoral y metastasis.

Durante el desarrollo embrionario, los vasos sangufneos se originan a partir de precursores endoteliales derivados del mesodermo en un proceso llamado vasculogenesis, mientras que la formación de los vasos linfaticos parece iniciarse a partir de un conjunto de celulas endoteliales venosas en la región yugular y perimesonefrica. Dado que su origen embrionario es comun, ambos sistemas vasculares comparten mecanismos moleculares similares que regulan su desarrollo y maduración. Se han identificado varias vfas de senalización en las que receptores tirosin quinasas juegan un papel muy importante en estos mecanismos de formación del sistema cardiovascular, en concreto, la vfa de senalización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a traves de sus correspondientes receptores (VEGFR) en cooperación con la actividad de receptores de Tie-1 y Tie-2 regulados por angiopoyetinas (Thurston, G. Cell Tissue Res. 2003; 314:61-68) . Ademas, se ha demostrado que otro grupo de moleculas, las ephrins (acrónimo del ingles "er y thropoietin producing hepatoma receptor interactors") , junto con sus correspondientes receptores (Eph) , tambien esta implicado en el remodelado del sistema vascular sangufneo (Adams, RH y Klein, R. Trends Cardiovasc Med. 2000; 10: 183-188) y linfatico (Makinen, T et al. Genes Dev. 2005; 19:397-410) . Esta familia comprende el mayor grupo de tirosin quinasas conocido, con 14 receptores y 8 ligandos, y se subdivide en dos categorías de receptores, Eph A y Eph B, en base a la homologfa de su secuencia y a las propiedades de unión a los correspondientes ligandos. Los receptores EphA se unen a los ligandos del subgrupo ephrin A, caracterizados por estar anclados a la membrana a traves de una molecula de glicosilfosfatidilinositol (GPI) , mientras que los receptores Eph B se unen a ligandos del subgrupo ephrin B, que se encuentran anclados a la membrana a traves de una región transmembrana seguida por un dominio citoplasmico. Se ha descrito que las arterias expresan el ligando transmembrana ephrin B2 y las venas expresan el receptor Eph B4 (Adams, RH y Alitalo K. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 464-478) .

Este grupo de moleculas son las responsables de la regulación de diversas funciones celulares como la morfologfa, migración, repulsión, adhesión e invasión celular modificando la organización del citoesqueleto e influenciando las actividades de integrinas y otras moleculas de adhesión intracelulares (Pasquale, EB. Cell 2008; 133:38-52) . Estas actividades dependen de la interacción de los receptores Eph expresados en una celula con la correspondiente ephrin expresada en otra, generando senales bidireccionales que afectan a cada una de las celulas implicadas. La senalización procedente del receptor Eph se denomina "directa", (del ingles "forrard") y depende del dominio tirosin quinasa presente en su región citoplasmica, el cual tiene capacidad de autofosforilarse y fosforilar a otras protefnas, y de la asociación del receptor con otras moleculas efectoras. Por su parte, el ligando ephrin B genera otra senalización denominada "inversa" (del ingles "reverse") dependiente por un lado de la fosforilación de varias tirosinas presentes en su región citoplasmica, llevada a cabo por quinasas de la familia Src y otros receptores tirosin quinasa, y, por otro lado, de otras protefnas asociadas. Ademas, la mayoría de los receptores Eph y las ephrins B presentan un sitio de unión a dominios PDZ en sus regiones citoplasmicas que es importante para realizar las funciones fisiológicas, particularmente de las ephrins B (Makinen, T et al. Genes Dev. 2005; 19:397-410) .

Estudios de inactivación de los genes que codifican para el Eph B4 y para la ephrin B2 en ratones transgenicos sugieren un papel fundamental de ambas protefnas en el desarrollo del sistema vascular. Ratones deficientes para estos genes presentan una angiogenesis alterada que es letal en estado embrionario (Wang, HU et al. Cell 1998; 93:741-753; Adams, RH et al. Genes Dev. 1999; 13:295-306) , mientras que el estudio de ratones que expresan ephrin B2 con mutaciones en sitios activos de senalización demostró que esta protefna controla el crecimiento angiogenico y linfoangiogenico a traves de la regulación de la vfa de senalización del VEGF (Wang, Y et al. Nature 2010; 465:483-6; Sawamiphak S et al. Nature 2010; 465:487-91) .

En W02007/127506 y en W02010/019565 se describen anticuerpos contra ephrin B2. En W02007/127506 se demuestra que los anticuerpos descritos bloquean la senalización entre ephrin B2 y Eph B4 y presentan un efecto inhibidor de la angiogenesis, capaz de disminuir el volumen tumoral en un modelo animal.

Sin embargo, la necesidad de nuevos agentes terapeuticos capaces de controlar la angiogenesis continua existiendo.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención aporta un nuevo agente terapeutico capaz de controlar la angiogenesis y se refiere a un nuevo anticuerpo contra ephrin B2, con una secuencia distinta a la de los anticuerpos descritos hasta la fecha y una alta especificidad, capaz de inhibir la formación de nuevos vasos sangufneos y linfaticos y de impedir considerablemente el crecimiento de tumores. Los anticuerpos contra ephrin B2 descritos en W02007/127506 son capaces de inhibir la angiogenesis, pero no se describe un efecto inhibidor de la linfoangiogenesis.

La presente invención se basa en anticuerpos que reconocen y se unen específicamente a la ephrin B2 y se refiere a dichos anticuerpos y a composiciones y metodos basados en ellos, que supone una herramienta terapeutica y diagnóstica importante contra aquellas patologfas asociadas a la ephrin B2.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a nuevos anticuerpos específicos contra ephrin B2 que tienen actividad antiangiogenica y antilinfoangiogenica, y son capaces de inhibir el crecimiento de tumores sólidos.

Esta invención aporta una nueva solución al problema de controlar enfermedades que cursan con trastornos de la angiogenesis,... [Seguir leyendo]

1. Un polipeptido aislado caracterizado porque:

(a) comprende una secuencia aminoacfdica de al menos un 76% de identidad de secuencia con SEQ I0 NO: 1 y (b) reconoce y se une específicamente a la ephrin B2.

2. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde la secuencia

aminoacfdica es SEQ I0 NO: 1.

3. El polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde

dicho polipeptido es un anticuerpo.

4. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde dicho anticuerpo es

humano.

5. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde el isotipo del

anticuerpo humano es IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgA.

6. El polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores

caracterizado porque ademas comprende un peptido senal.

7. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde el peptido senal es

SEQ I0 NO: 6.

8. El polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores

caracterizado porque ademas comprende al menos un marcador.

9. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde el marcador se selecciona de la lista que comprende: c-myc, FLAG, HA, cadena de histidinas, GST, biotina, VSV-G, HSVtk, V5, biotina, avidina, estreptavidina, protefna de union a maltosa y una protefna fluorescente.

1º. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde el marcador es una cadena de histidinas, c-myc o ambos.

11. El polipeptido segun la reivindicacion anterior donde la secuencia aminoacfdica de dicho polipeptido es SEQ I0 NO: 7.

12. Un anticuerpo contra ephrin B2 cuya secuencia aminoacfdica comprende el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

13. Un acido nucleico que codifica para el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o para el anticuerpo segun al reivindicacion

12.

14. Un vector que comprende el acido nucleico segun la reivindicacion anterior.

15. El vector segun la reivindicacion anterior donde el vector es un vector de eºpresion.

16. Una celula que comprende el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15.

17. La celula segun la reivindicacion anterior donde dicha celula es procariota.

18. La celula segun la reivindicacion 16 donde dicha celula es eucariota.

19. La celula segun la reivindicacion anterior donde dicha celula es una celula de mamffero.

2º. Un metodo de obtencion del polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o del anticuerpo segun la reivindicacion 12, que comprende las etapas (a) eºpresar el vector descrito segun la reivindicacion 15 en una celula y (b) purificar el polipeptido eºpresado en la etapa (a) .

21.El metodo segun la reivindicacion anterior donde la celula es procariota.

22. El metodo segun la reivindicacion 2º donde la celula es eucariota.

23. Un metodo de deteccion yºo cuantificacion de la ephrin B2 que comprende las etapas (a) poner en contacto una muestra biologica aislada con el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11

o con el anticuerpo segun al reivindicacion 12 y (b) detectar yºo cuantificar el compleºo formado por la ephrin B2 y dicho polipeptido o dicho anticuerpo, en la muestra empleada en (a) .

24. Un metodo de diagnostico de una enfermedad asociada a la eºpresion de la ephrin B2 que comprende las etapas (a) poner en contacto una muestra biologica aislada con el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o con el anticuerpo segun la reivindicacion 12, (b) detectar yºo cuantificar el compleºo formado por la ephrin B2 y dicho polipeptido o dicho anticuerpo en la muestra empleada en (a) , (c) comparar los niveles de ephrin B2 detectados con los niveles control y (d) asociar el resultado de dicha comparacion a la presencia o ausencia de la enfermedad.

25. Uso del polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o del anticuerpo segun la reivindicacion 12, para preparar un medicamento.

26. Uso segun la reivindicacion anterior para inhibir la angiogenesis.

27. Uso segun cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para el tratamiento profilactico o terapeutico de una condicion patologica

asociada a la angiogenesis.

28. Uso segun cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores para el tratamiento profilactico o terapeutico de un tumor o del cancer.

29. Uso segun la reivindicacion anterior donde el tumor o el cancer es solido.

3º. Uso segun la reivindicacion anterior donde el cancer es de pancreas, colon o pulmon.

31. Una composicion que comprende el polipeptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el anticuerpo segun la reivindicacifn 12, el acido nucleico segun la reivindicacion 13, el vector segun cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15 o la celula segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.

32. La composicion segun la reivindicacion anterior, donde dicha composicion es una composicion farmaceutica.

33.La composicion segun la reivindicacion anterior caracterizada porque ademas comprende un eºcipiente farmaceuticamente aceptable.

34. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 31 o 32 caracterizada porque ademas comprende un agente antiangiogenico.

35. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 31 o 32 caracterizada porque ademas comprende un agente quimioterapeutico.

36.Uso de la composicion segun cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores para preparar un medicamento.

37. Uso segun la reivindicacion anterior para inhibir la angiogenesis.

38. Uso segun cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para el tratamiento profilactico o terapeutico de una condicion patologica asociada a la angiogenesis.

39. Uso segun la reivindicacion anterior para el tratamiento profilactico o terapeutico de un tumor o del cancer.

4º. Uso segun la reivindicacion anterior donde el tumor o el cancer es solido.

41. Uso segun la reivindicacion anterior donde el cancer es de pancreas, colon o pulmon.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

Nº solicitud: 201031402

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 21.09.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C07K16/28 (2006.01) A61K39/395 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201031402

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C07K, A61K Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) EPODOC, WPI, EBI SECQUENCES DATABASES, CAPLUS, BIOSIS, MEDLINE , EMBASE

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031402

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 09.03.2012

Declaración

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201031402

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos específicos contra ephrin B2 que tienen actividad antiangiogénica y antilinfoangiogénica, y son capaces de inhibir el crecimiento de tumores sólidos. Concretamente el anticuerpo B11 que se describe la solicitud reconoce específicamente la ephrin B2 de manera que inhibe su unión al receptor Eph B4. La invención también reivindica su uso para detectar la proteína ephrin B2 y como medicamento para inhibir la angiogénesis y la linfoangiogénesis, en el tratamiento de enfermedades en las que estos procesos están implicados como, por ejemplo, el cáncer. 1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA El anticuerpo descrito en la invención consiste según la reivindicación 1 en un polipéptido aislado caracterizado porque:

(a) comprende una secuencia aminoacídica de al menos un 76% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 y

(b) reconoce y se une específicamente a la ephrin B2. Según la reivindicación 2 este polipéptido está caracterizado por la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1. A esta secuencia se añade un péptido señal y un marcador dando como resultado la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7 de la reivindicación 11. En el estado de la técnica no se ha localizado ninguna secuencia que presente un 100% de identidad con SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 7. Los documentos disponibles en el estado de la técnica que se consideran más cercanos a las secuencias reivindicadas en la invención son D01 y D02. En el documento D01 se describe una secuencia identificada como SEQ ID NO : 39 que presenta un 80.8% de identidad con SEQ ID NO: 1 en un solapamiento de 250 aa (1-250:1-243) . No obstante el documento D01 se refiere a un anticuerpo humano antiGPNMB por lo que no se puede considerar relevante en cuanto a la actividad inventiva de la reivindicación 1. Por su parte el documento D02 describe un anticuerpo humanizado específico del receptor 1 del factor de necrosis tumoral humano (huTNFR1) . La secuencia SEQ ID NO: 9 presenta un 78.8% de identidad con SEQ ID NO: 7 en un solapamiento de 302 aa (1-301:1-288) . En el estado de la técnica relativo a la invención existen además otros documentos, como D03-D05, que describen anticuerpos específicos contra ephrin B2, pero cuyas secuencias no presentan identidades relevantes con las secuencias reivindicadas en la presente solicitud. En opinión de esta Oficina, a la luz del estado de la técnica comentado anteriormente, las reivindicaciones 1-41 cumplen con los requisitos de novedad y actividad inventiva recogidos en los Art. 6.1 Y 8.1 LP

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