VIROSOMA QUE COMPRENDE PROTEÍNAS DEL VIRUS INFLUENZA Y DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B.

Virosoma que comprende proteínas del virus de influenza y del virus de la hepatitis B La presente invención se refiere a un virosoma que comprende una membrana virosómica que comprende al menos un lípido y proteínas de envuelta de un virus con envuelta, y partículas de la nucleocápsida de dicho virus con envuelta situadas en el interior y el exterior del virosoma y unidas a dichas proteínas de la envuelta. Además, la invención se refiere a una vacuna que comprende el virosoma de la invención y a un procedimiento para la producción de un virosoma de la invención. Además, la invención se refiere a un uso de un virosoma de la invención para la preparación de una vacuna, por ejemplo para prevenir o aliviar una enfermedad relacionada con una infección por VHB. El desarrollo de vacunas nuevas y cada vez más seguras a menudo hace uso de antígenos bien caracterizados, en particular proteínas recombinantes altamente purificadas o péptidos sintéticos. A pesar de algunos logros, este procedimiento está limitado por el hecho de que dichos antígenos a menudo son poco inmunógenos cuando se administran solos. Este hecho ha necesitado el desarrollo de sistemas adyuvantes y vehículos adecuados que tengan la capacidad de potenciar la inmunogenicidad de un antígeno dado. Un posible procedimiento es la integración de antígenos en una estructura superior, p. ej., una partícula similar a virus. La asociación física de todos los componentes de la vacuna en una sola partícula asegura su interacción simultánea con células inmunitarias individuales, y de esta forma, la explotación máxima de los potenciales sinérgicos. Esto tiene una importancia particular si se incluyen componentes inmunoestimuladores o inmunomoduladores (adyuvantes) en la formulación. Además, la propia estructura de la partícula puede tener efectos inmunoestimuladores y aumentar tanto la estabilidad como la inmunogenicidad de los componentes individuales. Por lo tanto, es un problema encontrar un procedimiento adecuado de combinación de antígenos relevantes en una formulación industrial aplicable, que conduzca a una aplicación profiláctica y/o terapéutica eficaz. Durante la replicación de un virus en una célula hospedadora, se generan copias del genoma vírico y las proteínas víricas son expresadas y procesadas antes de ensamblarse en los viriones maduros mientras se aprovechan de la infraestructura celular. La base común es que la replicación del virus y el ensamblaje de la progenie requieren un entorno de una célula hospedadora viva y una serie ordenada de interacciones específicas entre ácidos nucleicos víricos, proteínas víricas y de la célula hospedadora, y membranas lipídicas, lo que conduce a la segregación y ensamblaje de la estructura de virión macromolecular. El gran número de diferentes moléculas necesarias y además, las estructuras celulares implicadas, ilustran la alta complejidad de cualquier ensamblaje de virión. Hay diferencias principales entre las diferentes clases de virus, y en particular, entre los virus con envuelta y sin envuelta. Es común a todos los virus con envuelta la cubierta exterior del virus compuesta de una membrana lipídica con proteínas víricas integradas, y como consecuencia, la necesaria interacción entre las proteínas víricas solubles asociadas a la membrana o las estructuras basadas en proteínas, p. ej., las nucleocápsidas, con el fin de ensamblar un virus con envuelta maduro. Los virus sin envuelta carecen de una membrana basada en lípidos y se ensamblan solo a partir de moléculas de proteína y ácidos nucleicos. Se han descrito numerosos procedimientos para reconstituir partículas víricas in vitro e in vivo en la bibliografía y se pueden dividir en distintas categorías: (a) Reconstitución in vitro de envueltas víricas Las proteínas de la envuelta recombinantes o derivadas del virus se pueden purificar y formular con o sin lípidos adicionales en proteoliposomas. El procedimiento in vitro puro logra la generación de la cubierta exterior de los virus con envuelta, la envuelta, pero no incluye el núcleo del virus, la nucleocápsida. Hay ejemplos de estructuras virosómicas quiméricas que integran proteínas de la envuelta de diferentes virus. Las envueltas víricas reconstituidas también se han usado con éxito para la transferencia de genes (ADN o ARN) pero estos procedimientos no dependían del empaquetado de una nucleocápsida funcional basada en proteínas sino más bien de una asociación de ácidos nucleicos directamente con la envuelta reconstituida. (b) Expresión heteróloga de una o más proteínas víricas ES 2 365 738 T3 Las proteínas víricas recombinantes aisladas se pueden autoensamblar en estructuras similares a virus (VLP); VPH (levadura, baculovirus), VHC (baculovirus), antígeno HBs (levadura, CHO), HBc (E. coli). Es común a todos estos procedimientos que el autoensamblaje tenga lugar en el sistema de expresión celular heterólogo y posteriormente se purifican las partículas similares a virus. Por lo tanto, el ensamblaje no tiene lugar in vitro sino que se basa en el 2 (c) Reconstitución de virus sin envuelta (icosaédricos) o partículas similares a virus in vitro Este procedimiento se basa en componentes purificados por separado. Debido a la ausencia de una envuelta basada en una membrana lipídica, los virus sin envuelta son más sencillos en su estructura y se pueden autoensamblar en determinadas condiciones in vitro si todo los componentes necesarios están presentes en la estequiometría correcta. Igualmente, el núcleo interior de los virus con envuelta, las nucleocápsidas sin lípidos o 10 subunidades de las mismas, se han reconstituido in vitro a partir de componentes recombinantes purificados, p. ej. del virus de influenza (Martin-Benito J. et al. (2001) EMBO Rep. 2(4): 313-7). sistema celular. Las VLP se han usado como vacunas y como vehículos de vacunas. (Pumpens, P.; Grens, E. (2001) lntervirology 44 (2-3); 98-114; Noad R, Roy P. (2003) Trends Microbiol. 11 (9): 438-44). (d) Purificación de nucleocápsidas víricas ES 2 365 738 T3 Se han extraído y purificado nucleocápsidas de muchos tipos diferentes de virus con el fin de caracterizar su composición. Estas preparaciones también se pueden usar para la transfección de células susceptibles destinadas al rescate de virus. El rescate de virus satisfactorio implica que se aislado una nucleocápsida funcional y se ha suministrado al citoplasma de una célula hospedadora. Sin embargo, esto no implica la reconstitución satisfactoria de un virus con envuelta funcional, porque mediante el uso de un transfectante se evita la forma natural de infección que depende de una envuelta funcional, mediando el transfectante el suministro directo de la nucleocápsida al citoplasma de una célula hospedadora. (e) Pseudotipificación de virus con envuelta y vectores víricos en un sistema de cultivo celular Este procedimiento in vivo se ha usado ampliamente y con éxito para la producción de virus o vectores quiméricos (p. ej. retrovirus, lentivirus y VAA) a escala de laboratorio. El elemento clave para la producción de virus pseudotipificados es una célula auxiliar que expresa simultáneamente todas las proteínas que se van a integrar en el virión y media el ensamblaje de los viriones. Por el contrario, un ensamblaje in vitro de un virus con envuelta se basa en componentes definidos, producidos por separado y purificados, y la asociación física se lleva a cabo en condiciones controladas in vitro (Sandrin V. et al. (2003) Curr. Top Microbiol. Immunol.; 281:137-78). Como forma específica de partículas similares a virus, los virosomas son un sistema de vehículo/adyuvante de vacuna clínica probado con un excelente perfil de seguridad y tolerancia en seres humanos. La capacidad del vehículo virosómico para mediar el procesamiento de antígeno tanto por la ruta exógena como la endógena, hace de este sistema un buen candidato para una vacuna terapéutica. El concepto básico de los virosomas comprende la reconstitución in vitro de envueltas víricas vacías, o más en general, de proteínas de envuelta víricas integradas en una bicapa lipídica esférica. Los virosomas se han generado a partir de una serie de virus (Y. Kaneda. (2000) Adv. Drug Delivery Rev. 43, 197-205; Drummond DC. et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39(5): 409-60). Se ha demostrado la posibilidad de producir virosomas quiméricos que contienen proteínas de la envuelta de dos virus diferentes (Bagai S., Sarkar D.P. (1994) FEBS Lett. 353(3): 332-6). En todos los casos, la proteína vírica de interés tiene una estructura transmembrana o anclada a la membrana, que es un requisito previo para la integración espontánea. La formulación virosómica de moléculas que no interaccionan directamente con la membrana lipídica virosómica es mucho más difícil de lograr. Aunque la idea de conectar moléculas a estructuras... [Seguir leyendo]

(a) una membrana virosómica que comprende al menos un lípido, una proteína de la envuelta del virus de influenza y una proteína de la envuelta del virus de la hepatitis B (VHB); y (b) partículas de la nucleocápsida que comprenden la proteína del núcleo del VHB (HBc), situadas en el interior y el exterior del virosoma y unidas a dichas proteínas de la envuelta. 2. El virosoma de la reivindicación 1, en el que dicho al menos un lípido comprende al menos un fosfolípido. 3. El virosoma de la reivindicación 2, en el que dichos fosfolípidos comprenden fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. 4. El virosoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichas proteínas de la envuelta del virus de influenza son la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). 5. Una vacuna que comprende el virosoma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y opcionalmente un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y/o un adyuvante. 6. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el adyuvante es RC529. 7. Un procedimiento para producir un virosoma, que comprende las etapas de: (a) solubilizar proteínas de la envuelta de los virus con envuelta de influenza y VHB en presencia de un lípido en una disolución de detergente; (b) disminuir la concentración del detergente en la disolución; (c) añadir partículas de la nucleocápsida del VHB que comprenden la proteína HBc a la disolución obtenida en la etapa (b); y (d) separar el detergente para así producir los virosomas. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho lípido comprende al menos un fosfolípido. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dichos fosfolípidos comprenden fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. 10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que dichas proteínas de la envuelta del virus de influenza son la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA). 11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que además comprende la etapa (b) llevada a cabo después de la etapa (b): (b) filtración estéril de la dilución obtenida en la etapa (b). 12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, que además comprende la etapa (e) de filtración estéril de la dilución obtenida en la etapa (d). 13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que el detergente es un detergente no iónico. 14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el detergente no iónico es el éter mono(N-dodecílico) del octaetilenglicol (OEG). 15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, en el que el detergente no iónico se ajusta en la etapa (b) a una concentración en el intervalo de 20 mM a 100 mM. 16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en el que la relación de lípido:proteína está en el intervalo de 1:1 a 10:1. 5 17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la relación de lípido:proteína es aproximadamente 5:1. ES 2 365 738 T3 18. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en el que la parte de fosfatidilcolina en el virosoma es 22%. 19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, en el que la relación de HA:proteína de la envuelta vírica:proteína de la cápsida vírica es 1:1:1. 20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 19, que además 15 comprende la adición de un adyuvante antes de la producción de los virosomas en la etapa (d). 21. Uso de un virosoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, u obtenido por un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 20, para preparar una vacuna. 20 22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que dicha vacuna es para prevenir o aliviar una infección por el VHB. 21 ES 2 365 738 T3 22 ES 2 365 738 T3 23 ES 2 365 738 T3 24 ES 2 365 738 T3 influenza ES 2 365 738 T3 26 ES 2 365 738 T3 27 ES 2 365 738 T3 28 ES 2 365 738 T3 29 Alumn- HBx/HBc ES 2 365 738 T3 ES 2 365 738 T3 31