VECTORES VÍRICOS Y SU USO EN MÉTODOS TERAPÉUTICOS.

Un virus del herpes simple que comprende una mutación de inactivación en el locus ICP47 del virus,

en donde dicha mutación ocurre entre el sitio BstEII y el sitio EcoNI del fragmento BamH1 que abarca la región ICP47, en donde la mutación coloca el US11 bajo el control del promotor temprano inmediato ICP47.

Campo de la Invención

Esta invención se relaciona con virus y su uso en métodos terapéuticos.

Antecedente de la Invención

El uso de vectores competentes para replicación vírica, tal como los vectores del virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1), es una estrategia atractiva para la terapia de tumor, debido a que tales virus se pueden replicar y propagar in situ, exhiben actividad oncolítica a través del efecto citopático directo (Kirn, J. Clin. Invest. 105:837-839, 2000). Se ha desarrollado un número de vectores HSV-1 oncolíticos que tienen mutaciones en los genes asociados con neurovirulencia y/o síntesis de ADN vírica, con el fin de restringir la replicación de estos vectores a las células transformadas y no provoca enfermedad (Martuza, J. Clin. Invest. 105:841-846, 2000).

En el diseño de los vectores víricos para uso clínico, es esencial que se utilicen amplias protecciones. El G207 es un vector HSV-1 oncolítico derivado de la cepa F HSV-1 tipo natural (Mineta et al., Nat. Med. 1:938-943, 1995). Este tiene eliminaciones en ambas copias del determinante principal de la neurovirulencia del HSV, el gen γ34.5 y una inserción de inactivación del gen LacZ E. coli en UL39, que codifica la proteína de célula infectada 6 (ICP6) (Mineta et al., Nat. Med. 1:938-943, 1995). La ICP6 es la subunidad grande de reductasa de ribonucleótido, una enzima clave para el metabolismo de nucleótido y la síntesis de ADN vírico en las células sin división pero no en células en división (Goldstein et al., J. Virol. 62:196-205, 1988). Además de ser el principal determinante de la neurovirulencia del HSV (Chou et al., Science 250:1262-1266, 1990), el ICP34.5 también funciona al bloquear la interrupción inducida por las céluas anfitrionas de la síntesis de proteína en respuesta a la infección vírica (Chou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3266-3270, 1992). Esto es probablemente responsable del crecimiento menos eficiente de los mutantes γ34.5 -comparado con el HSV tipo natural, que ha sido observado en muchos tipos de células de tumor (McKie et al., Br. J. Cancer 74:745-752, 1996; Andreansky et al., Cáncer Res. 57: 1502-1509, 1997; Chambers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:1411-1415, 1995). Esta mutación doble confiere ventajas importantes: oportunidad mínima de revertir a tipo natural, la replicación preferencial en las células de tumor, neurovirulencia atenuada, e hipersensibilidad de ganciclovir/aciclovir. El G207 mata efectivamente múltiples tipos de células de tumor en el cultivo y en ratones que tienen tumores subcutáneamente o intracranealmente (Mineta et al., Nat. Med. 1:938-943, 1995; Yazaki et al., Cancer Res. 55:4752-4756, 1995; Toda et al., Hum. Gene Ther. 9:2177-2185, 1998; Todo et al., Hum. Gene Ther. 10:2741-2755, 1999; Chahlavi et al., Neoplasia 1:162-169, 1999; Kooby et al., FASEB J. 13:13251334, 1999; Lee et al., J. Gastrointest. Surg. 3:127-133, 1999). En diversos modelos de tumor singeneicos en ratones inmunocompetentes, la oncólisis originada por inoculación intraneoplásica de G207 provoca una respuesta inmune sistémica y linfocitos T citotóxicos específicos de tumor (Todo et al., Hum. Gene Ther. 10:2741-2755, 1999; Toda et al., Hum. Gene Ther. 10:385-393, 1999; Todo et al., Hum. Gene Ther. 10:2869-2878, 1999).

El G207 tiene toxicidad mínima cuando se inyecta en los cerebros de ratones susceptibles a HSV-1 o primates diferentes de humanos (Hunter et al., J. Virol. 73:6319-6326, 1999; Sundaresan et al., J. Virol. 74:3832-3841, 2000; Todo et al., Mol. Ther. 2: 588-595, 2000). Recientemente, se ha examinado el G207 en pacientes con glioma maligno recurrente (Markert et al., Gene Ther. 7:867-874, 2000), y los resultados de este ensayo clínico fase I indican que la inoculación intracerebral de G207 es segura en dosis de hasta 3 x 109 unidades formadoras de placa (pfu), la dosis más alta probada. Aunque el uso de virus oncolíticos es un método promisorio para terapia oncológica, los beneficios terapéuticos dependerán probablemente de la dosis y la ruta de administración, el grado de replicación vírica intratumoral, y la respuesta inmune anfitriona.

La infección de HSV-1 provova regulación por disminución de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I en la superficie de las células anfitrionas infectadas (Jennings et al., J. Virol. 56:757-766, 1985; Hill et al., J. Immunol. 152:2736-2741, 1994). La unión del ICP47 al transportador asociado con la presentación de antígeno (TAP) bloquea el transporte de péptido antigénico en el retículo endoplásmico y carga las moléculas MHC clase I (York et al., Cell 77:525-535, 1994; Hill et al., Nature 375:411-415, 1995; Früh et al., Nature 375:415-418, 1995). La unión de ICP47 es específica de las especies para los TAP de mamíferos grandes (Jugovic et al., J. Virol. 72:5076-5084, 1998), con la afinidad de TAP de murino aproximadamente 100 veces menor que para el humano (Ahn et al., EMBO J. 15:3247-3255, 1996).

Resumen de la invención La invención proporciona virus del herpes simple (por ejemplo, virus HSV-1) que incluyen mutaciones dentro del fragmento BstEII -EcoNI del fragmento BamHI x de los virus. Estos virus también pueden incluir, por ejemplo, una mutación de inactivación en el locus de neurovirulencia γ34.5 de los virus, y/o una mutación de inactivación en el locus ICP6 de los virus.

También se incluyen en la invención el virus del herpes simple (por ejemplo, un virus HSV-1) que incluye una mutación de inactivación en el locus ICP47 de los virus, en la ausencia de una mutación de inactivación en el locus de neurovirulencia γ34.5 del virus. Opcionalmente, estos virus también pueden incluir una mutación de inactivación en el locus ICP6 de los virus.

La invención también se puede utilizar para inducir una respuesta inmune sistémica al cáncer en un paciente, que implica administrar al paciente un virus de herpes que incluye una mutación de inactivación en el locus ICP47 del virus de herpes. El virus de herpes se puede administrar, por ejemplo, a un tumor del paciente. Adicionalmente, el paciente puede tener o estar en riesgo de desarrollar cáncer metastásico, y el tratamiento se puede llevar a cabo para tratar o evitar tal cáncer. La mutación de inactivación en el locus ICP47 de los virus de herpes está en el fragmento BstEII -EcoNI del fragmento BamHI x del virus. Opcionalmente, el virus puede incluir una mutación de inactivación en el locus de neurovirulencia γ34.5 del virus de herpes, y/o una mutación de inactivación en el locus ICP6 del virus de herpes.

La invención también proporciona virus de herpes que incluyen una primera mutación que inactiva el locus de neurovirulencia γ34.5 de los virus y una segunda mutación que resulta en la expresión temprana de US11, en la ausencia de una mutación de inactivación ICP47 en el fragmento BamHI x de los virus. Se puede lograr la expresión temprana de US11, por ejemplo, al insertar un promotor en la dirección 5' del gen US11, o al insertar un gen US11 bajo el control de un promotor de expresión temprana en el genoma del virus. Los virus también pueden incluir una mutación que resulta en la regulación por disminución de la expresión ICP47, en la ausencia de una mutación en el fragmento BamHI x del virus. La regulación por disminución de ICP47 puede ser debido a, por ejemplo, una eliminación de, o inactivación de, el promotor ICP47, o la fusión de ICP47 con un péptido que evita la expresión funcional de ICP47.

Los virus descritos anteriormente también pueden incluir una mutación adicional (por ejemplo, una mutación en el locus ICP6) para evitar la reversión al tipo natural. Los virus también pueden incluir, opcionalmente, las secuencias que codifican un producto de gen heterólogo, tal como un antígeno de vacuna o una proteína inmunomoduladora. Los virus descritos aquí pueden ser un virus del herpes simple (HSV), tal como virus del herpes simple-1 (HSV-1).

La invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que incluyen cualquiera de los virus descritos aquí y un portador, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable, que se puede utilizar para tratar cáncer en un paciente, que involucra administrar tal una composición farmacéutica al paciente. La invención también se puede utilizar para inmunizar un paciente contra una enfermedad infecciosa, cáncer, o una enfermedad autoinmune,... [Seguir leyendo]

1. Un virus del herpes simple que comprende una mutación de inactivación en el locus ICP47 del virus, en donde dicha mutación ocurre entre el sitio BstEII y el sitio EcoNI del fragmento BamH1 que abarca la región ICP47, en donde la mutación coloca el US11 bajo el control del promotor temprano inmediato ICP47.

2. El virus de la reivindicación 1, en donde la mutación es una eliminación.

3. El virus de las reivindicaciones 1 y 2, que comprende adicionalmente mutaciones adicionales, preferiblemente seleccionadas de una mutación de inactivación en el locus de determinación de neurovirulencia γ34.5 y el locus ICP6.

4. El virus de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente una mutación de inactivación en el locus de neurovirulencia γ34.5 de dicho virus y una mutación de inactivación en el locus ICP6 de dicho virus.

5. Un virus del herpes simple que comprende una mutación de inactivación en el gen γ34.5 y una mutación que resulta en la expresión temprana de US11 en la ausencia de una mutación de inactivación ICP47 en el fragmento BamH1 que abarca la región ICP47.

6. El virus de la reivindicación 5, en donde la expresión temprana de US11 se logra al insertar un promotor que actúa temprano en la dirección 5' del gen US11.

7. El virus de la reivindicación 6, en donde el promotor que actúa temprano se selecciona de un promotor heterólogo que es activo antes del inicio de la replicación de ADN en el genoma HSV-1, preferiblemente el promotor CMV IE, promotor HSV-1 IE y promotor HSV-1 E.

8. El virus de la reivindicación 5 a 7, en donde dicho virus comprende una mutación que resulta en la regulación por disminución de la expresión ICP47, en la ausencia de una mutación en dicho fragmento BamHI.

9. El virus de la reivindicación 8, en donde dicha regulación por disminución de la expresión ICP47 se debe a una eliminación en, o inactivación de, el promotor ICP47.

10. El virus de la reivindicación 9, en donde dicho virus codifica ICP47 que se fusiona con un péptido que evita la expresión funcional de ICP47.

11. El virus de acuerdo con la reivindicación 6, en donde un promotor que actúa temprano se inserta en la dirección 5' del gen US11 y ICP47 que codifica las secuencias se fusionan con las secuencias que codifican una secuencia veneno, preferiblemente una secuencia PEST.

12. El virus de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el promotor que actúa temprano se selecciona de un promotor heterólogo que se activa antes del inicio de la replicación de ADN en el genoma HSV-1, preferiblemente el promotor CMV IE, promotor HSV-1 IE y promotor HSV-1 E.

13. El virus de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicha regulación por disminución de la expresión ICP47 se debe a una eliminación en, o inactivación de, el promotor ICP47.

14. El virus de las reivindicaciones 5 a 13, en donde dicho virus codifica ICP47 que se fusiona con un péptido que evita la expresión funcional de ICP47.

15. El virus de la reivindicación 5 a 14, que comprende adicionalmente una mutación adicional para evitar la reversión tipo natural.

16. El virus de las reivindicaciones 5 a 15, en donde dicha mutación adicional está en el locus ICP6.

17. El virus de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende adicionalmente las secuencias que codifican un producto de gen heterólogo.

18. El virus de la reivindicación 17, en donde dicho producto de gen heterólogo comprende un antígeno de vacuna o una proteína inmunomoduladora, preferiblemente citoquinas.

19. El virus de las reivindicaciones 1 a 18, en donde dicho virus del herpes simple es un virus del herpes simple-1.

20. Una composición farmacéutica que comprende el virus de las reivindicaciones 1 a 19 y un portador, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable.

21. El virus de las reivindicaciones 1 a 19 para uso en un método para tratar el cáncer en un paciente.

5 22. El virus de las reivindicaciones 1 a 19 para uso en un método para inmunizar un paciente contra una enfermedad infecciosa, cáncer, o una enfermedad autoinmune.

23. El virus de las reivindicaciones 1 a 19 para uso en un método para inducir una respuesta inmune sistémica al cáncer en un paciente, dicho método comprende administrar a dicho paciente tal virus.

24. El virus para uso en un método de la reivindicación 21 a 23, en donde dicho virus de herpes se administra a un tumor de dicho paciente.

25. El virus para uso en un método de la reivindicación 21 a 23, en donde dicho paciente tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer metastásico.