Una composición que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un transgén flanqueado por dos repeticiones terminales y un ácido nucleico que codifica una enzima de integración bajo el control de un elemento promotor,

en la que la enzima de integración es una enzima de integración quimérica que comprende un dominio de unión al ADN específico de anfitrión y en la que el ácido nucleico que codifica el transgén y el ácido nucleico que codifica la enzima de integración quimérica son el mismo ácido nucleico, y en la que la enzima de integración quimérica es una transposasa

I. Antecedentes de la invención

Las investigaciones han revelado tres componentes principales para el transporte eficaz de vectores virales y no viralesa través de la membrana citoplásmica y en el núcleo de las células eucariotas. Éstos incluyen un ligando específico para la endocitosis mediada por receptor, un factor de disrupción endosomal y una señal de localización nuclear. Estos componentes se han empleado con éxito en vectores no virales (1-6). En vectores que carecen de o que no pueden interaccionar con una señal de localización nuclear, la transfección eficaz sólo ocurrirá en aquellas células que se dividen activamente. Los tres requerimientos de ADN para la integración son (1) la secuencia de ADN, (2) una estructura de ADN local del anfitrión, y (3) las proteínas de unión al ADN endógenas asociadas [45]. Para que ocurra la integración, se requiere una enzima (p. ej., transposasa) para mediar el proceso. Esta enzima puede ser una transposasa o una recombinasa específica de sitio. Las recombinasas específicas de sitio permiten la recombinación y algunas no requieren cofactores permitiendo de esta manera una actividad fuera de su entorno normal. Por ejemplo, la recombinasa Cre, aunque se obtiene del fago P1 de Escherichia coli, actúa eficazmente en células de plantas, levaduras y de mamíferos (18). Las recombinasas selectivas de sitio tales como FLP, Cre y -recombinasa llevan a cabo tanto la integración como la escisión eficazmente con los mismos sitios diana; sin embargo, la frecuencia neta de integración es baja (p. ej., 0,03% para Cre) (18-20).

Las limitaciones de los vectores virales tales como patogenicidad, gasto de la producción e inestabilidad sistémica han resultado obstáculos importantes en el uso de sistemas basados en virus. De hecho, la readministración de vectores basados en virus puede estimular respuestas inmunes que pueden resultar en efectos sistémicos potencialmente mortales y limitar la eficacia de la transferencia génica (64-65). Los vectores no virales (es decir, basados en lípidos, basados en polímeros, basados en lípidos-polímeros y polilisina) son medios sintéticos para encapsular el ADN transgénico hasta que alcanza la diana celular. Comparados con los vectores virales, los vectores no virales son más seguros de preparar; se disminuye el riesgo de complicaciones patogénicas e inmunológicas. Los vectores no virales se han diseñado modificando la superficie del vector no viral para la terapia dirigida (7-12). Los liposomas típicamente se internalizan en los endosomas, que frecuentemente son dirigidos a los lisosomas, degradando así el plásmido. En estos vectores se han empleado factores de disrupción endosomal y las señales de localización nuclear. Sin embargo, los lipoplexos (ADN plasmídico y liposoma) están limitados principalmente a la transfección de células en división a no ser que esté presente o que interaccione con el vector un factor de localización nuclear (16). Además, la integración eficaz en el anfitrión no ocurre excepto en los plásmidos basados en transposones (17-20). No obstante, se ha demostrado que los liposomas son seguros en los ensayos de terapia génica en seres humanos (21-24).

Los transposones son móviles, respecto a que pueden moverse de una posición en el ADN a una segunda posición en el ADN en presencia de una transposasa. Existen dos componentes fundamentales en cualquier sistema de transposón móvil de tipo corte y pega, una fuente de una transposasa activa y las secuencias de ADN que son reconocidas y movilizadas por la transposasa. La movilización de las secuencias de ADN permite que también se movilice el ácido nucleico implicado entre las secuencias de ADN reconocidas.

La integrasa y retrotransposasa dependen de su propio dominio de unión al ADN o una interacción con un factor de direccionamiento de ADN del anfitrión para dirigir el complejo ADN-enzima (p. ej., transposón/transposasa) en yuxtaposición con el ADN del anfitrión para que ocurra la integración (25, 35-37).

Si el anfitrión no tiene este factor de direccionamiento o una secuencia de ADN específica del anfitrión reconocida por el complejo transposón/transposasa, la eficacia de la integración disminuye sustancialmente (25, 38). Por ejemplo, se ha mostrado que una proteína endógena humana específica, integrasa que interacciona 1, se une a la integrasa y estimula la integración in vitro y posiblemente in vivo mediante la unión y direccionamiento de la integrasa a los sitios hipersensibles de la ADNasa 1 (25). Alternativamente, el elemento semejante a retrovirus de levaduras Ty3 se inserta en los sitios de comienzo de la transcripción de genes transcritos por la ARN polimerasa III mediante su unión con este complejo (37). Además, algunas transposasas o integrasas requieren determinados sitios en el ADN del anfitrión para su actividad catalítica incluso si el complejo ADN-enzima se pone próximo al ADN del anfitrión. Por ejemplo, el transposón Tc1/mariner se integra en un dinucleótido TA (32).

Los elementos de ADN transponibles para manipulación genética han estado disponibles desde hace más de 15 años. Esta tecnología se ha aplicado tanto en bacterias como eucariotas para verificar si un fragmento de ADN clonado contiene o no el gen funcional completo de interés. Rubin y Spradling fueron los primeros en demostrar esto para los elementos P de D. melanogaster. Un fragmento de ADN que porta el gen rosy se insertó en las repeticiones terminales de un elemento P y se clonó en un plásmido. Este plásmido y otro que codificaba la transposasa se inyectaron en los embriones de una cepa M con una deleción en el gen rosy. Aproximadamente el 50% de las moscas obtenidas de los embriones inyectados poseían el fenotipo rosy, sugiriendo de esta manera que el gen rosy se había insertado en el cromosoma y había mantenido su función en distintos sitios en el genoma. Además, ninguno de los ADN plasmídicos que flanquean se había integrado en el genoma del anfitrión lo que sugiere que la escisión del plásmido sólo había tenido lugar en las repeticiones terminales (39).

Para que un ácido nucleico codificado en un vector se incorpore en el ADN diana debe producirse la integración. El modelo putativo de integración es similar en los retrovirus, transposones y retrotransposones semejantes a retrovirus. Por ejemplo, el dominio catalítico está conservado en las integrasas y las transposasas. Las reacciones in vitro han mostrado que la integrasa o transposasa son las únicas enzimas necesarias para la integración (25-28). Se ha mostrado que la integrasa y muchas transposasas en bacterias y eucariotas se unen específicamente al sitio att en los extremos de las repeticiones terminales. Requieren la presencia de CA en el extremo 3' tanto para el procesamiento como la escisión/ligación (29-30).

Los transposones tienen muchas aplicaciones en la manipulación genética de un genoma anfitrión, incluyendo la administración transgénica y la mutagénesis insercional. Sin embargo, la eficacia de la integración del transposón puede variar sustancialmente entre las líneas celulares, lo que sugiere la implicación de factores del anfitrión. Tomando como base los requerimientos para la integración de los elementos transponibles, parece que es necesario un factor de direccionamiento de ADN del anfitrión para una integración eficaz por yuxtaposición del complejo transposóntransposasa adyacente al ADN del anfitrión. El requerimiento de un factor de direccionamiento de ADN del anfitrión se ha establecido en retrovirus y retrotransposones semejantes a retrovirus. Por ejemplo, el elemento semejante a retrovirus de levadura Ty3 se inserta en los sitios de comienzo de la transcripción de genes transcritos por la ARN polimerasa III mediante su interacción con este complejo [82]. Alternativamente, la integrasa del virus de la inmunodeficiencia humana se une a la proteína integrasa endógena humana que interacciona 1 para estimular la integración in vitro y posiblemente in vivo [83, 25]. De hecho, las transposasas Tc1/mariner también tienen sitios de unión al ADN. Sin embargo, estos dominios de unión al ADN aparentemente no son selectivos de sitio (35), posiblemente carecen de sitios de reconocimiento fuerte en determinados genomas anfitriones, y pueden requerir otras proteínas del anfitrión para una integración eficaz por acoplamiento de transposón-transposasa con el ADN del anfitrión.

En muchos casos, el anfitrión no tiene el factor de acoplamiento requerido tal como una secuencia de ADN reconocida por la transposasa o un factor endógeno que yuxtapone el complejo transposón-transposasa al ADN del anfitrión. Así, la... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un transgén flanqueado por dos repeticiones terminales y un ácido nucleico que codifica una enzima de integración bajo el control de un elemento promotor, en la que la enzima de integración es una enzima de integración quimérica que comprende un dominio de unión al ADN específico de anfitrión y en la que el ácido nucleico que codifica el transgén y el ácido nucleico que codifica la enzima de integración quimérica son el mismo ácido nucleico, y en la que la enzima de integración quimérica es una transposasa.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el elemento promotor es un promotor/amplificador.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el promotor es un promotor específico de sitio.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el promotor específico de sitio puede seleccionarse de al menos el grupo que consiste en el promotor de la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP), promotor de mielina básica (MBP), promotor MCK, promotor NSE, promotor de nestina, promotor de sinapsina, promotor de Insulina 2 (Ins2), promotor PSA, promotor de la albúmina, promotor TRP-1, el promotor de tirosinasa, el promotor EIIA, un promotor específico de tejido de mama, tal como el promotor WAP, un promotor específico de tejido de ovarios, tal como el promotor ACTB o un promotor específico de téjido óseo.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que el promotor es inducible.

6. La composición de la reivindicación 5, en la que el promotor inducible puede seleccionarse de al menos uno del grupo que consiste en el promotor del choque por calor humano, promotor Egr-1, promotor de tetraciclina, sistema recombinasa cre-lox y el promotor de la calicreína glandular humana 2 (hK2).

7. La composición de la reivindicación 1, en la que la transposasa quimérica puede seleccionarse de al menos una del grupo que consiste en Bella Durmiente (SB), mosl, piggyBac, Himarl, Hermes, elemento To 12, Pokey, Tn7, Tn916, maT, Tc1/mariner y Tc3.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión al ADN específico del anfitrión de la enzima de integración quimérica se fusiona con el extremo N terminal de la transposasa.

9. La composición de la reivindicación 1, en la que el dominio de unión al ADN específico del anfitrión de la enzima de integración quimérica se fusiona con el extremo C terminal de la transposasa.

10. La composición de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima de integración quimérica está localizada fuera de las repeticiones terminales.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el dominio de unión al ADN específico del anfitrión se selecciona del grupo que consiste en proteínas con homeodominio, proteínas con dedo de cinc, receptores de hormonas, proteínas hélice-giro-hélice, proteínas hélice-bucle-hélice, proteínas cremallera básicas (bZip) y factores lazo beta.

12. Una construcción de ácido nucleico que comprende i) un transgén flanqueado por dos repeticiones terminales, ii) una enzima de integración quimérica en la forma de una transposasa bajo el control de un elemento promotor capaz de dirigir la expresión de dicha transposasa, y iii) un dominio de unión al ADN específico del anfitrión.

13. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 12 para usarse como un medicamento.