Una variante polipeptídica del Factor VlI (FVII) o Factor Vlla (FVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3 - 15 modificaciones de aminoácidos con relación al Factor VII humano (hFVII) o Factor Vlla humano (hFVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:

2, en la que la secuencia de aminoácidos de la variante comprende sustituciones de aminoácido en las posiciones 10 y 32 en la SEQ ID NO:2 y en la que un resto de azúcar está unido de manera covalente a al menos un sitio introducido de N-glicosilación in vivo localizado en el dominio Gla, en el que al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por a sustitución en la SEQ ID NO:2 seleccionada entre el grupo que consiste en A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315A+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N y D334N

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a variantes polipeptídicas novedosas de los polipéptidos del factor VII (FVII) o factor Vlla (FVlla) polipéptidos, donde dichas variantes comprenden una sustitución de aminoácido en la posición 10 y 32 y donde dichas variantes además comprenden un resto de azúcar unido de manera covalente a un sitio introducido in 5 vivo de N-glicosilación .

La presente invención también se refiere al uso de tales variantes polipeptídicas en terapia, en particular para el tratamiento de una diversidad de trastornos relacionados con la coagulación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La coagulación de la sangre es un proceso que consiste en una interacción compleja de diversos componentes 10 (o factores) de sangre que eventualmente da como resultado un coágulo de fibrina. En general, los componentes de sangre que participan en lo que se ha mencionado como la "cascada de coagulación" son proenzimas y zimógenos, es decir proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten en una forma activa por la acción de un activador. Uno de dichos factores de coagulación es FVII.

FVII es una proteína de plasma dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre 15 como una glicoproteína de de una sola cadena con un peso molecular de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255: 1242 - 1247). El zimógeno FVII se convierte en una forma activada (FVlla) mediante escisión proteolítica en un único sitio, R152-I153, que da como resultado dos cadenas ligadas por un único puente disulfuro. FVlla en complejo con el factor tisular (complejo FVlla) es capaz de convertir tanto el factor IX como el factor X en sus formas activadas, seguido de las reacciones que conducen a una rápida producción de trombina y formación de fibrina (Østerud & 20 Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5260 - 5264).

FVII se somete a modificaciones después de la traducción, incluyendo la carboxilación dependiente de la vitamina K que da como resultado diez restos de ácido γ-carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. De este modo, el número de resto 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 25 26,29 y 35 mostrado en la SEQ ID NO:2 son ácidos γ-carboxiglutámicos en el dominio Gla importante para la actividad de FVII. Otras modificaciones después de la traducción 25 incluyen unión de resto de azúcar a dos sitios de N-glicosilación de origen natural en la posición 145 y 322, respectivamente, y dos sitios de O-glicosilación de origen natural en la posición 52 y 60, respectivamente.

El gen que codifica FVII humano (hFVII) se ha mapeado para el cromosoma 13 en q34- qter 9 (de Grouchy et al., Hum Genet 1984; 66: 230 - 233). Contiene nueve exones y extensiones de 12,8 Kb (O'Hara et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 5158 - 5162). La organización génica y estructura de proteína FVII son similares a las de otras 30 proteínas procoagulantes dependientes de la vitamina K, con exones 1a y 1b que codifican la secuencia de señal; exón 2 el propéptido y dominio Gla; exón 3 una corta región hidrófoba; exones 4 y 5 los dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico; y exón 6 a 8 el dominio catalítico de la serina proteasa (Yoshitake et al., Biochemistry 1985; 24: 3736 - 3750).

Existen reseñas sobre estructuras experimentales de tres dimensiones de hFVlla (Pike et al., PNAS. Estados 35 Unidos., 1999; 96: 8925 - 30 y Kemball-Cook et al., J. Struct. Biol, 1999; 127: 213 - 223); de hFVlla en complejo con el factor de tejido soluble usando procedimientos cristalográficos de rayos X (Banner et al., Nature, 1996; 380: 41 y Zhang et al., J. MoI. Biol, 1999; 285: 2089); y de fragmentos más pequeños de hFVl1 (Muranyi et al., Biochemistry, 1998; 37: 10605 y Kao et al., Biochemistry, 1999; 38: 7097).

Se han reseñado algunas variantes modificadas por ingeniería de proteína de FVII véase, por ejemplo, 40 Dickinson & Ruf, J Bio Chem, 1997; 272: 19875 - 19879, Kemball-Cook et al., J. Biol Chem, 1998; 273: 8516 - 8521, Bharadwaj et al., J Biol Chem, 1996; 271: 30685 - 30691, Ruf et al., Biochemistry, 1999; 38: 1957 - 1966; documentos WO 99/20767; WO 00/11416; WO 02/22776; WO 02/38162; WO 01/83725; WO 01/58935; US 5.580.560.

Shah et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 14 de abril de 1998; 95 (8): 4229 -34, y Nelsestuen et al., J Biol Chem. 26 de octubre de 2001; 276 (43): 39825 - 31 reseñan estudios funcionales que comparan el Factor Vlla de tipo salvaje 45 con un mutante de Factor Vlla que tiene mutaciones en las posiciones 10 y 32 (P10Q/032E).

Existen reseñan sobre la expresión de FVII en BHK u otras células de mamíferos (documentos WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y co-expresión de FVII y kex2 endoproteasa en células eucarióticas (documento WO 00/28065).

Las preparaciones comerciales de FVlla recombinante humano se venden como NovoSeven®. NovoSeven® 50 está indicada para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rhFVlla para el tratamiento eficaz y fiable de episodios de hemorragia disponibles en el mercado.

Una forma inactiva de FVII en la que arginina 152 y / o isoleucina 153 es / están modificadas se ha reseñado en el documento W091/1154. Estos aminoácidos están localizados en el sitio de activación. El documento WO 96/12800 describe inactivación de FVlla por un inhibidor de serina proteinasa; inactivación por carbamilación de FVlla en el grupo 55 α-aminoácido I153 se ha descrito por Petersen et al., Eur J Biochem, 1999; 261 :124 - 129. La forma inactivada es

capaz de competir con FVII o FVlla de tipo salvaje que se une al factor de tejido tisular e inhibir la actividad de coagulación. La forma inactivada de FVlla se sugiere que se use para el tratamiento de pacientes que están en estados hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis, en riesgo de infarto de miocardio o de apoplejía trombótica.

Una semivida de rhFVlla circulante de 2.3 horas se reseñó en "Summary Basis for Approval for NovoSeven®", número de referencia de FDA 96-0597. Relativamente altas dosis y la administración frecuente son necesarios para 5 alcanzar y mantener el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Como una consecuencia de regulación de dosis adecuada es difícil obtener y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes impone restricciones de en la forma de vida del paciente.

En relación con el tratamiento de hemorragia sin controlar, tal como trauma, se cree que el factor Vlla es capaz de activar el factor X al factor Xa sin unirse al factor tisular, y esta reacción de activación se cree que se produce 10 principalmente en las plaquetas de sangre activadas (Hedner et al. Blood Coagulation & Fibrinolysis, 2000; 11; 107 - 111). Sin embargo, hFVlla o rhFVlla tiene una baja actividad hacia el factor X en la ausencia del factor tisular y, por consiguiente, tratamiento de hemorragia sin controlar, por ejemplo en pacientes con trauma, requiere dosis relativamente altas y múltiples de hFVlla o rhFVlla. Por lo tanto, con el fin de tratar las hemorragias no controladas más eficazmente (para minimizar la pérdida de sangre) existe necesidad de moléculas de FVlla mejoradas, que posean una 15 alta actividad hacia el factor X en la ausencia del factor tisular. Tales moléculas de FVlla mejoradas mostrarán un tiempo de coagulación reducido (o acción más rápida) cuando se compara con rhFVlla cuando se administra asociado a hemorragias sin controlar.

Una molécula con una semivida de circulación más larga disminuiría el número de administraciones necesarias. Dada la asociación del producto de rhFVlla actual con inyecciones frecuentes, y el potencial para obtener 20 niveles de FVlla terapéuticos más óptimos con efecto terapéutico potenciado simultáneo, existe una clara necesidad de moléculas de tipo FVII- o FVlla mejoradas.

Una forma de incrementar la semivida en circulación de una proteína es asegurar que la eliminación renal de la proteína se reduce. Esto se puede lograr mediante conjugación de la proteína a un resto químico, que es capaz de conferir eliminación renal reducida para la proteína. 25

Además, la unión de un resto químico a la proteína o sustitución de aminoácidos expuestos a proteolisis puede bloquear de manera eficaz una enzima proteolítica del contacto que conduce a la degradación proteolítica de la proteína. Polietilen glicol...

1. Una variante polipeptídica del Factor VlI (FVII) o Factor Vlla (FVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende 3 - 15 modificaciones de aminoácidos con relación al Factor VII humano (hFVII) o Factor Vlla humano (hFVlla) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, en la que la secuencia de aminoácidos de la variante comprende sustituciones de aminoácido en las posiciones 10 y 32 en la SEQ ID NO:2 y en la que un resto 5 de azúcar está unido de manera covalente a al menos un sitio introducido de N-glicosilación in vivo localizado en el dominio Gla, en el que al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por a sustitución en la SEQ ID NO:2 seleccionada entre el grupo que consiste en A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205S, I205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315A+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N y D334N. 10

2. La variante de la reivindicación 1, en la que la sustitución en la posición 10 es P10Q.

3. La variante de la reivindicación 1 ó 2, en la que la sustitución en la posición 32 es K32E.

4. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos una modificación de aminoácido adicional en el dominio Gla.

5. La variante de la reivindicación 4, en la que la modificación adicional en el dominio Gla comprende una sustitución de 15 aminoácido en la posición 33.

6. La variante de la reivindicación 4 ó 5, en la que la modificación adicional en el dominio Gla comprende la inserción de un resto de aminoácido hidrófobo entre la posición 3 y 4.

7. La variante de la reivindicación 6, en la que la inserción es A3AY.

8. La variante de cualquiera de las reivindicaciones 4 - 7, en la que la modificación adicional en el dominio Gla 20 comprende una sustitución de aminoácido en la posición 34.

9. La variante de la reivindicación 8, en la que un resto de aminoácido cargado negativamente se introduce por sustitución en la posición 34.

10. La variante de la reivindicación 9, en la que la sustitución es A34E.

11. La variante de la reivindicación 10, que comprende las sustituciones P100+K23E+A34E. 25

12. La variante de la reivindicación 10, que comprende las modificaciones A3AY+P100+K32E+A34E.

13. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por una sustitución seleccionada entre el grupo consiste en A51N, G58N, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, I205T, V253N, T267N+S269T, S314N+K316T, R315N+V317T, K316N+G318T, G318N y D334N

14. La variante de la reivindicación 13, en la que el al menos un sitio de N-glicosilación in vivo se introduce por a 30 sustitución seleccionada entre el grupo consiste en T106N, A175T, I205T, V253N and T267N+S269T.

15. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dos o más sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustitución.

16. La variante de la reivindicación 15, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustituciones seleccionadas entre el grupo consiste en A51N+G58N, A51N+T106N, A51N+K109N, A51N+G124N, 35 A51N+K143N+N145T, A51N+A175T, A51N+I205T,A51N+V253N, A51N+T267N+S269T, A51N+S314N+K316T, A51N+R315N+V317T, A51N+K316N+G318T, A51N+G318N, A51N+D334N, G58N+T106N, G58N+K109N, G58N+G124N, G58N+K143N+N 145T, G58N+A175T, G58N+I205T, G58N+V253N, G58N+T267N+S269T, G58N+S314N+K316T, G58N+R315N+V317T, G58N+K316N+G318T, G58N-G318N, G58N+D334N, T106N+K109N, T106N+G124N, T106N+K143N+N 145T, T106N+A175T, T106N-I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, 40 T106N+S314N+K316T, T106N+R315N+V317T, T106N+K316N+G318T, T106N+G318N T106N+D334N, K109N+G124N, K109N+K143N+N145T, K109N+A175T, K109N-I205T, K109N+V235N, K109N+T267N+S269T, K109N+S314N+K316T, K109N+R315N+V317T, K109N+K316N+G318T, K109N+G318N, K109N+D334N, G124N+K143N+N145T, G124N+A175T, G124+I205T, G124N+V253N, G124N+T267N+S269T, G124N+S314N+K316T, G124N+R315N+V317T, G124N+K316N+G318T, G124N+G318N, G124N+D334N, K143N+N145T+A175T, 45 K143N+N145T+I205T, K143N+N145T+V253N, K143N+N145T+T267N+S269T, K143N+N145T+S314N+K316T, K143N+NI45T+R315N+V317T, K143N+N145T+K316N+G318T, K143N+N145T+G318N, K143N+N145T+D334N, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, A175T+S314N+K316T, A175T+R315N+V317T, A175+K316N+G318T, A175T+G318N, A175T+D334N, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T, I205T+S314N+K316T, I205T+R315N+V317T, I205T+K316N+G318T, I205T+G318N, I205T+D334N, V253N+T267N+S269T, 50 V253N+S314N+K316T, V253N+R315N+V317T, V253N+K316N+G318T, V253N+G318N V253N+D334N, T267N+S269T+S314N+K316T, T267N+S269T+R315N+V317T, T267N+S269T+K316N+G318T, T267N+S269T+G318N, T267N+S269T+D334N, S314N+K316T+R315N+V317T, S314N+K316T+G318N, S314N+K316T+D334N, R315N+V317T+K316N+G318T, R315N+V317T+G318N, R315N+V317T+D334N y G318N+D334N.

17. La variante de la reivindicación 16, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustituciones seleccionadas entre el grupo consiste en T106N+A175T, T106N+I205T, T106N+V253N, T106N+T267N+S269T, A175T+I205T, A175T+V253N, A175T+T267N+S269T, I205T+V253N, I205T+T267N+S269T y V253N+T267N+S269T.

18. La variante de la reivindicación 17, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustituciones seleccionadas entre el grupo constituido por T106N+I205T, T106N+V253N y I205T+T267N+S269T. 5

19. La variante de la reivindicación 18, en la que dos sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por las sustituciones T106N+V235N.

20. La variante de la reivindicación 15, en la que tres sitios de N-glicosilación in vivo se han introducido por sustitución.

21. La variante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la variante está en su forma activada.

22. Una secuencia de nucleótidos que codifica una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 10 - 21.

23. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos como se ha definido en reivindicación 22.

24. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos como se ha definido en reivindicación 22 o un vector de expresión como se ha definido en la reivindicación 23, en la que la célula huésped es una célula gamma-carboxilante capaz de glicosilación in vivo. 15

25. Una composición farmacéutica que comprende una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

26. Una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 para uso como un medicamento.

27. Uso de una variante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 21 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento hemorragia no controlada. 20

28. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona entre el grupo consiste en hemorragias, incluyendo hemorragias cerebrales, hemorragias no controladas graves, tal como trauma, hemorragias en pacientes que se someten a transplantes en vivo, hemorragias en pacientes que experimentan hemorragias varicosas.

29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la enfermedad o trastorno es trauma. 25

30. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la enfermedad o trastorno es hemorragia cerebral.