Una variante de polipéptido del Factor VII o Factor VIIa, teniendo dicha variante una secuencia de aminoácidos que difiere del Factor VII humano o del Factor VIIa humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO:

1 en no más de 15 restos aminoácidos, en la que dicha secuencia variante comprende la sustitución L65Q y posee actividad de coagulación mejorada o tiempo de coagulación reducido en comparación con hFVIIa o rhFVIIa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a variantes de FVII o FVIIa novedosas que comprenden L65Q de sustitución. Dichas variantes presentan actividad de coagulación mejorada. La presente invención se refiere también a uso de dichas variantes de polipéptido en terapia, en particular para el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la coagulación.

Antecedentes de la invención

La coagulación de la sangre es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes de la sangre (o factores) que dan eventualmente como resultado un coágulo de fibrina. Por lo general, los componentes de la sangre que participan en lo que se ha denominado como “cascada de coagulación” son proenzimas o cimógenos, es decir, proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten en una forma activa mediante la acción de un activador. Uno de estos factores de coagulación es FVII.

FVII es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K sintetizada en el hígado y secretada en la sangre como una proteína monocatenaria con un peso molecular de 53 kDa (Broze y Majerus, J Biol Chem 1980; 255: 1242-1247). El cimógeno FVII se convierte en una forma activada (FVIIa) mediante escisión proteolítica en un único sitio, R152-I153, que da como resultado dos cadenas unidas por un único puente disulfuro. FVIIa en complejo con el factor tisular (FT), el complejo FVIIa, es capaz de convertir el factor IX y el factor X en sus formas activadas, seguido por las reacciones que conducen a una rápida producción de trombina y la formación de fibrina (Østerud y Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5260-5264).

FVII experimenta modificaciones después de la traducción, incluyendo carboxilación dependiente de vitamina K, dando como resultado diez restos de ácido -carboxiglutámico en la región N-terminal de la molécula. De esta manera, los números de restos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 que se muestran en la SEC DE ID Nº: 1 son restos de ácidos carboxiglutámicos en el dominio Gla importantes para la actividad de FVII. Otras modificaciones después de la traducción incluyen la unión de un resto azúcar a dos sitios de N-glicosilación que se producen naturalmente en la posición 145 y 322, respectivamente, y a dos sitios de O-glicosilación que se producen naturalmente en la posición 52 y 60, respectivamente.

Se ha cartografiado el gen que codifica FVII humano (hFVII) hasta el cromosoma 13 en q34-qter 9 (de Grouchy y col., Hum Genet 1984; 66: 230-233). Contiene nueve exones y tiene una extensión de 12,8 kb (O'Hara y col., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 5158-5162). Esta organización génica y estructura proteica de FVII son similares a las de otras proteínas procoagulantes dependientes de vitamina K, con exones Ia y 1b que codifican la secuencia señal, el exón 2 el propéptido y el dominio Gla; el exón 3 una corta región hidrófoba; los exones 4 y 5 los dominios del tipo del factor de crecimiento epidérmico, y del exón 6 al 8 en el dominio catalítico de la serina proteasa (Yoshitake y col., Biochemistry 1985; 24: 3736-3750).

Existen informes sobre estructuras tridimensionales experimentales de hFVIIa (Pike y col., PNAS USA 1999; 96: 8925-30 y Kemball-Cook y col., J Struct Biol 1999; 127: 213-223), de hFVIIa en complejo con factor tisular soluble usando procedimientos cristalográficos de rayos X (Banner y col., Nature 1996; 380: 41 y Zhang y col., J Mol Biol 1999; 285: 2089), y de fragmentos más pequeños de hFVII (Muranyi y col., Biochemistry 1998; 37: 10605 y Kao y col., Biochemistry 1999; 38: 7097).

Se ha informado de algunas variantes de proteínas FVII diseñadas (Dickinson y Ruf, J Biol Chem 1997; 272: 1987519879; Kemball-Cook y col., J Biol Chem 1998; 273: 8516-8521; Bharadwaj y col., J Biol Chem 1996; 271: 30685-30691; Ruf y col., Biochemistry 1999; 38: 1957-1966, Documentos US 5.560.580; US 5.288.629; WO 01/83725; WO 02/22776; WO 02/077218; WO 03/027147; WO 02/38162; WO 03/037932; WO 99/20767; WO 00/66753 y WO 01/58935).

Existen informes sobre la expresión de FVII en BHK u otras células de mamíferos (documentos WO 92/15686, WO 91/11514 y WO 88/10295) y la expresión simultánea de FVII y la endoproteasa kex2 en células eucariotas (WO 00/28065).

Preparaciones comerciales de FVIIa recombinante humano se comercializan como NovoSeven®. NovoSeven® está indicado para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B. NovoSeven® es la única rFVIIa para el tratamiento eficaz y fiable disponible en el mercado para episodios de hemorragias.

Se ha informado en el documento WO 91/11514 de una forma inactiva de FVII en la cual la arginina 152 y/o la isoleucina 153 está/están modificadas. Estos aminoácidos están localizados en el sitio de inactivación. El documento WO 96/12800 describe la inactivación de FVIIa por un inhibidor de la serina proteasa. Petersen y col., Eur J Biochem 1999; 261: 124-129 han descrito la inactivación por carbamilación de FVIIa en el grupo α-amino ácido I153. La forma inactivada es capaz de competir con las FVII o FVIIa naturales por la unión a TF e inhibir la actividad de coagulación. Se ha sugerido el uso de la forma inactivada de FVIIa para el tratamiento de pacientes que están en estados hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis, en riesgo de infarto de miocardio o de apoplejía trombótica.

El documento WO 98/32466 sugiere que FVII, entre otras muchas proteínas, puede PEGilarse, pero no contiene ninguna información a este respecto.

El documento WO 01/58935 da a conocer una nueva estrategia para desarrollar moléculas de FVII o FVIIa que tienen, entre otras, una semivida aumentada.

Se ha informado de una semivida de rFVIIa en circulación de 2,3 horas en "Summary Basis for Approval for NovoSeven®", FDA número de referencia 96-0597. Son necesarias dosis relativamente elevadas y una administración frecuente para alcanzar y sostener el efecto terapéutico o profiláctico deseado. En consecuencia es difícil obtener una regulación de la dosis adecuada, y la necesidad de frecuentes administraciones intravenosas impone restricciones en el modo de vida del paciente

El tratamiento con rFVIIa podría volverse más eficaz si se pudiera usar una forma de FVIIa diseñada de tal modo que esté mejorada su unión al FT. Sin desear quedar vinculado a una teoría específica, dicha variante FVIIa podría mejorar el tratamiento mediante el siguiente mecanismo: una molécula de FVIIa modificada con afinidad aumentada por FT podría permitir un tratamiento más eficaz de la hemorragia debido a su capacidad de sustituir la FVII inactiva o la FVIIA inactivada en el FT mediando por ese medio una amplificación más fuerte de la ruta de la coagulación y aceleraría por tanto el proceso de formación del coágulo y mediaría incluso posiblemente la formación de un coágulo más fuerte. De esta manera, dicha FVIIa mejorada podría ser más eficaz en la detención de sangrados incontrolados, por ejemplo, en pacientes con trauma.

Esta eficacia aumentada se localizará en lugares de tejido con daño debido a que este es el único lugar en el que están presentes las células (células endoteliales) que soportan el FT activo. De esta manera, además de la eficacia aumentada, una FVIIa modificada con afinidad aumentada por el FT constituirá un tratamiento procoagulante más seguro debido a la localización de la actividad en los sitios de lesión tisular, es decir, en las células que se exponen procedentes del endotelio, es decir, en los sitios en los que es deseable un aumento de actividad procoagulante.

De acuerdo con esto, el principal objeto de la presente invención es proporcionar variantes de FVII/FVIIa con una eficacia de coagulación mejorada, tal como una actividad de coagulación mejorada (tiempo de coagulación reducido) y/o una capacidad para generar coágulos más fuertes. Las variantes pueden diseñarse adicionalmente para obtener una afinidad de unión a la membrana de fosfolípidos aumentada. Dichas variantes aumentarán la eficacia de FVIIa incluso adicionalmente debido a que la molécula puede dirigir el FT presente en las plaquetas a través de su fusión con las así denominadas micropartículas germinadas procedentes por ejemplo de monocitos que producen FT. Este direccionamiento localizará simultáneamente el aumento en la generación de Factor X con el resto de la cascada de coagulación, es decir, en el sitio de formación de la trombina y la fibrina.

Otro problema con el tratamiento... [Seguir leyendo]

1. Una variante de polipéptido del Factor VII o Factor VIIa, teniendo dicha variante una secuencia de aminoácidos que difiere del Factor VII humano o del Factor VIIa humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 1 en no más de 15 restos aminoácidos, en la que dicha secuencia variante comprende la sustitución L65Q y posee actividad de coagulación mejorada o tiempo de coagulación reducido en comparación con hFVIIa o rhFVIIa.

2. La variante según la reivindicación 1, que comprende además al menos una sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en L39E, L39Q, L39H, 142R, S43H, S43Q, K62E, K62R, L65S, F71 D, F71 Y, F71E. F71 Q, F71 N, E82Q, E82N, E82K y F275H.

3. La variante según la reivindicación 2, en la que dicha al menos una sustitución es F71Y, K62E o S43Q.

4. La variante según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha variante comprende al menos una sustitución de aminoácido en el domino Gla.

5. La variante según la reivindicación 4, en la que al menos dicha una sustitución en el dominio Gla comprende una sustitución en al menos una posición seleccionada entre el grupo que consiste en P10, K32, D33 y A34

6. La variante según la reivindicación 5, en el que dicha variante comprende además una inserción de al menos un resto de aminoácido entre la posición A3 y F4.

7. La variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que se ha introducido al menos un resto aminoácido que comprende un grupo de unión de un resto no polipeptídico en una posición localizada en el exterior del dominio Gla.

8. La variante según la reivindicación 7, en la que dicho grupo de unión es un sitio de glicosilación in vivo.

9. La variante según la reivindicación 8, en la que dicho sitio de glicosilación in vivo es un sitio de N-glicosilación introducido por una sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en A51 N, G58N, G48N+S60T, T106N, K109N, G124N, K143N+N145T, A175T, 1205S, 1205T, V253N, T267N, T267N+S269T, S314N+K316S, S314N+K316T, R315N+V317S, R315N+V317T, K316N+G318S, K316N+G318T, G318N, y D334N.

10. La variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha variante comprende además al menos una sustitución en la posición seleccionada entre el grupo que consiste en 157, 158, 296, 298, 305, 334, 336, 337 y 374.

11. La variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha variante comprende además al menos una sustitución seleccionada entre el grupo que consiste en K341 Q, D196K, D196N, G237L y G237GAA.

12. La variante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha variante está en su forma activada.

13. Una secuencia de nucleótidos que codifica una variante tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12.

14. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se define en la reivindicación 13.

15. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se define en la reivindicación 13

o un vector de expresión tal como se define en la reivindicación 14.

16. La célula hospedadora según la reivindicación 15, en la que dicha célula hospedadora es una célula gamma carboxilante capaz de glicosilación in vivo.

17. Una composición farmacéutica que comprende una variante tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

18. Una variante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, o una composición farmacéutica tal como se define en la reivindicación 17 para uso como un medicamento.

19. Uso de una variante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno en la que es deseable la formación de coágulo.