VACUNAS DE PÉPTIDOS SINTÉTICAS PARA VIH: EL EPÍTOPO DE CBD COMO UN INMUNÓGENO EFICAZ PARA PROVOCAR ANTICUERPOS AMPLIAMENTE NEUTRALIZANTES CONTRA EL VIH.

Vacunas de péptidos sintéticas para VIH: el epítopo de CBD como un inmunógeno eficaz para provocar anticuerpos ampliamente neutralizantes contra el VIH. Antecedentes y técnica anterior ES 2 366 185 T3 La presente solicitud se refiere a péptidos, denominados péptidos CBD-1, CBD-2, CBM-1/TH-1, CBM-1/TH-2, CBM­ 2/TH-1, CBM-2/TH-2 y C-20, que son inmunogénicos y provocan una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por VIH in vitro. Se dan a conocer asimismo unas composiciones terapéuticas o farmacéuticas y unas vacunas que comprenden estos péptidos antigénicos, así como unos anticuerpos neutralizantes que inhiben la infección por VIH y, cuando se añaden a células ya infectadas, provocan la producción de partículas de VIH defectuosas. Se dan a conocer asimismo unos procedimientos para el diagnóstico del VIH. La molécula gp41 de VIH-1 es una proteína transmembrana con varias características importantes dentro de su ectodominio (residuos de aminoácidos de 512 a 681; la numeración es según Dong et al. (1). En primer lugar, el extremo amino terminal de gp41, creado por escisión proteolítica del precursor gp160, contiene un péptido de "fusión" rico en glicina, hidrófobo que es esencial para la fusión a la membrana. En segundo lugar, existen dos dominios que contienen hélice en los extremos N y C-terminal de gp41 con un motivo de secuencia característico de superhélices. Entre estos dos dominios de -hélice existe el dominio inmunodominante que incluye un pequeño bucle. Los dos dominios que contienen -hélice se disponen en haces de seis hélices muy estables. Tres N-hélices (aminoácidos 545-590) forman un trímero con superhélice paralela interior, mientras que tres C-hélices (aminoácidos 628-661) se empaquetan de manera antiparalela oblicua en hendiduras hidrófobas altamente conservadas en la superficie de este trímero. Esta estructura representa de manera probable el núcleo de gp41 activo en la fusión (2, 3). Se demostró que un péptido sintético denominado T-20 (aminoácidos 638-673 de gp41), correspondiente al dominio C-hélice de gp41, bloqueaba la entrada por fusión inducida por VIH en cultivos celulares e infección por VIH en individuos infectados por el virus (4, 5). El mecanismo de esta inhibición se debe a la unión del péptido T-20 al dominio N-hélice. Por tanto, el bloqueo de la entrada del VIH en las células normales es uno de los medios para llegar a inhibir la infección por VIH. Es conocido que las balsas lipídicas desempeñan un papel importante durante el proceso de entrada del VIH en las células diana (6). Las balsas lipídicas son microdominios de membrana enriquecidos con glicolípidos, que son fundamentales en la organización lateral de la membrana plasmática formando plataformas que están implicadas en la agrupación de proteínas de membrana, endocitosis, transducción de señales y tráfico en la membrana (7, 8, 9, 10). Las balsas lipídicas contienen estructuras basadas en colesterol y esfingolípidos que están asociadas con proteínas de membrana específicas tales como proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) CD59 y CD90. Las balsas lipídicas que contienen caveolina como el componente de proteína clave se conocen como caveolas. Las caveolinas se unen al colesterol directamente, lo que estabiliza la formación de complejos homo-oligoméricos de caveolina (10). Mientras las balsas lipídicas parecían ser de pequeño tamaño y estar dispersas todo alrededor de la membrana plasmática de células no polarizadas, la interacción de las proteínas asociadas a la balsa con sus ligandos o su reticulación con anticuerpos conducen a la oligomerización de los componentes de la balsa (9, 11). Las balsas lipídicas con sus proteínas asociadas pueden aislarse en virtud de su insolubilidad en el detergente no iónico, Triton X-100® (8). Se ha notificado que varios patógenos, incluyendo los virus, utilizan las balsas lipídicas y caveolas como la ruta de endocitosis o ejerciendo sus efectos patógenos (7, 12). En el caso del VIH-1, varios grupos han notificado la implicación de las balsas lipídicas en la entrada viral (6, 13, 14) y los procesos de gemación (15, 16, 17). El VIH-1 infecta células diana mediante la capacidad de su complejo gp120-gp41 de glicoproteínas de la envuelta para unirse a las células e inducir la fusión del virus a las membranas celulares, un proceso que conduce a la entrada del virus (18). La glicoproteína de la envuelta externa contiene el sitio de unión para el receptor de CD4 y una región hipervariable de aproximadamente 36 aminoácidos denominada bucle V3. La glicoproteína transmembrana contiene un péptido de fusión potencial en su extremo amino terminal, que está implicado en el proceso de fusión a la membrana. Las glicoproteínas transmembrana y externas (gp120-gp41 para VIH-1) se asocian de manera no covalente para generar un complejo funcional, gp120 determina el tropismo viral uniéndose a receptores de la célula diana, mientras que gp41 media la fusión entre membranas celulares y virales. El complejo de receptor esencial para la entrada del VIH en las células consiste en la molécula de CD4 y por lo menos un miembro de la familia de receptores de quimiocina; CCR5 es el co-receptor principal para los aislados de VIH-1 macrófago-trópicos (R5), mientras que para aislados de linfocito T-trópico (X4) el co-receptor principal es CXCR4 (19, 20). Varias observaciones han apuntado también que la unión inicial de partículas de VIH a las células diana se produce a través de la interacción coordinada del bucle V3 con la nucleolina y proteoglicanos tipo heparán sulfato expresados en la superficie celular (21, 22, 23, 24). Compatible con la implicación de las balsas lipídicas en el proceso de entrada del VIH-1, CD4, CXCR4 y CCR5 producen la partición y señalización en las balsas tras la agrupación inducida por gp120 (14) o la reticulación de las partículas de VIH unidas a la superficie celular (6), mientras que el funcionamiento de los receptores de quimiocina y 2 ES 2 366 185 T3 CD4 parece requerir su asociación en las balsas lipídicas (25, 26). La reducción de colesterol celular por el fármaco ß-ciclodextrina hace que las línea células y células primarias sean altamente resistentes a formación de sincitio mediado por VIH-1 y también a la infección por ambas cepas de VIH-1 X4 y R5 (27). La transcitosis epitelial del VIH­ 1 también utiliza la ruta de la balsa lipídica como un mecanismo de transporte para llegar desde el lado apical hasta el lado basolateral de la célula (28). Además, se ha demostrado que las balsas lipídicas desempeñan un papel crítico en la liberación y ensamblaje del VIH-1 que tiene lugar en la membrana plasmática. Tanto el gen gag del VIH­ 1 como la proteína de la envuelta parecen estar asociados con las balsas lipídicas, un proceso que es necesario para el ensamblaje de las proteínas de VIH en la membrana plasmática y para la gemación de viriones (16, 17). Recientemente, se ha notificado que la coexpresión de caveolina-1 con VIH-1 bloquea la producción de virus en gran parte inhibiendo la síntesis de proteína viral, aunque no se excluyeron algunos efectos secundarios en la gemación del VIH (15). Se encontró que la región en caveolina-1 responsable de este último efecto inhibidor es el dominio hidrófobo asociado a la membrana (residuos de 101 a 135), mientras que se demostró que los primeros 100 aminoácidos N-terminales, que incluyen los dominios de soporte y oligomerización, son prescindibles (15). Finalmente, la transcitosis del VIH a través de las células epiteliales ha demostrado estar mediada por la capacidad de las partículas del virus para unirse a los receptores del glicoesfingolípido galactosil ceramida en las caveolas (28). Las caveolas son una forma especializada de balsas lipídicas definidas por la presencia de un marcador de proteína específico, la caveolina. Presentan una composición de lípidos única, principalmente compuesta de colesterol y esfingolípidos (10). Existen múltiples formas de caveolina: caveolina-1 y caveolina-2 se expresan como complejos heterooligoméricos estables dentro de la mayoría de tipos de células, mientras que la caveolina-3 se restringe a células de músculo estriado. Observaciones recientes han señalado que las células implicadas en la infección por VIH, tales como linfocitos, macrófagos y células dendríticas expresan caveolina-1 en la superficie celular (Harris et al., 2002). La caveolina-1 contiene 178 residuos de aminoácidos. Se cree que su dominio hidrófobo central (aminoácidos 102-134) forma una estructura similar a una horquilla dentro de la membrana tanto con el dominio Nterminal (aminoácidos 1-101) como con el dominio C-terminal (aminoácidos 135-178) orientados hacia el citoplasma. Se ha definido un dominio corto en los aminoácidos 82 a 101 en la... [Seguir leyendo]

1. Composición farmacéutica que comprende por lo menos un péptido capaz de provocar anticuerpos neutralizantes que bloquean la infección por VIH, consistiendo dicho por lo menos un péptido en por lo menos una de las siguientes secuencias peptídicas: a. L-E-Q-I-W-N-N-M-T-W-M-Q-W-D-K (SEC ID nº 2), una secuencia peptídica del dominio de unión a caveolina 1 (CDB-1), en la que SEC ID nº 2 presenta entre 0 y 20 aminoácidos añadidos a los extremos N- y C-terminal de dicho por lo menos un péptido; b. C-T-T-A-V-P-W-N-A-S-W-S-N-K-S-L-E-Q-I-W-N-N-M-T-W-M-Q-W-D-K (SEC ID nº 4), un motivo de unión a caveolina 1 en el ectodominio de la secuencia peptídica de la glicoproteína de la envuelta transmembrana 1 (CMB-1/TH-1), en la que SEC ID nº 4 presenta entre 0 y 20 aminoácidos añadidos a los extremos N- y C-terminal de dicho por lo menos un péptido; c. C-H-T-T-V-P-W-P-N-D-S-L-T-P-D-W-N-N-M-T-W-M-Q-W-D-K (SEC ID nº 5), un motivo de unión a caveolina 1 en el ectodominio de la secuencia peptídica de la glicoproteína de la envuelta transmembrana (CMB-1/TH--2), en la que SEC ID nº 5 presenta entre 1 y 20 aminoácidos añadidos a los extremos N- y C-terminal de dicho por lo menos un péptido; o d. variantes que presentan por lo menos del 90% al 99,9999% de homología de secuencia con las secuencias peptídicas tal como se definen en SEC ID nº 2, 4 y 5. 2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el péptido en la composición farmacéutica consiste en por lo menos una de las siguientes secuencias de aminoácidos: a. L-E-Q-I-W-N-N-M-T-W-M-Q-W-D-K (SEC ID nº 2), una secuencia peptídica del dominio de unión a caveolina 1 (CDB-1), b. C-T-T-A-V-P-W-N-A-S-W-S-N-K-S-L-E-Q-I-W-N-N-M-T-W-M-Q-W-D-K (SEC ID nº 4), un motivo de unión a caveolina 1 en el ectodominio de la secuencia peptídica de la glicoproteína de la envuelta transmembrana 1 (CMB-1/TH-1); c. C-H-T-T-V-P-W-P-N-D-S-L-T-P-D-W-N-N-M-T-W-M-Q-W-D-K (SEC ID nº 5), un motivo de unión a caveolina 1 en el ectodominio de la secuencia peptídica de la glicoproteína de la envuelta transmembrana (CMB-1/TH--2); o d. variantes que presentan por lo menos del 90% al 99,9999% de homología de secuencia con las secuencias peptídicas tal como se definen en SEC ID nº 2, 4 y 5. 3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 ó 2, en la que dichas variantes pueden reaccionar inmunológicamente con anticuerpos producidos contra SEC ID nº:2 (CBD1), SEC ID nº:4 (CBM/TH1) o SEC ID nº:6 (CBM/TH2), respectivamente. 4. Utilización de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un fármaco. 5. Utilización de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de una vacuna. 6. Vacuna que comprende por lo menos uno de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 7. Vacuna según la reivindicación 6 o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un adyuvante. 8. Vacuna o composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que dicho adyuvante se selecciona de entre el grupo constituido por: adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante incompleto Montanide de Seppic, sistema de adyuvante Ribi, Titer Max, péptidos de muramilo, formulación adyuvante Syntex, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, adyuvantes de sales de aluminio, adyuvantes Gerbu®, antígeno absorbido por nitrocelulosa, antígeno atrapado o encapsulado, Quil A y QS-21, oligonucleótidos CpG y moléculas de ARN bicatenario. 9. Vacuna o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que dicha vacuna o composición farmacéutica se presenta de una manera polivalente o multimérica. 38 ES 2 366 185 T3 10. Vacuna, o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 6 a 8, en la que dicha vacuna o composición farmacéutica está encapsulada con un polímero, liposoma o micela. 11. Ácido nucleico que codifica para los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico del mismo. 12. Anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos oligoclonales específicamente producidos contra cualquiera de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 13. Anticuerpos monoclonales según la reivindicación 12, que son anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan con cualquiera de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 14. Anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos oligoclonales según la reivindicación 12 ó 13, que son anticuerpos neutralizantes. 15. Procedimiento para detectar la presencia de VIH en una muestra biológica, que comprende poner en contacto la muestra biológica tomada de un mamífero con un anticuerpo según la reivindicación 12 ó 13, en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico; y detectar el complejo inmunológico que se forma. 16. Kit para detectar VIH que comprende por lo menos un anticuerpo según la reivindicación 12 ó 13, reactivos necesarios para la reacción inmunológica y reactivos necesarios para la detección del complejo inmunológico. 17. Utilización de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, para la preparación de medicamentos para tratar o prevenir la infección por VIH. 18. Procedimiento para medir la presencia de anticuerpos neutralizantes en una muestra biológica de un mamífero que comprende poner en contacto la muestra biológica tomada con un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico; y detectar el complejo inmunológico que se forma. 19. Kit para poner en práctica el procedimiento según la reivindicación 18, que comprende por lo menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, reactivos necesarios para la reacción inmunológica y reactivos necesarios para la detección del complejo inmunológico. 20. Utilización de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en un ensayo inmunológico in vitro para el diagnóstico de individuos positivos para VIH considerados como no progresores (NP) en comparación con los progresores (PR). 21. Péptido purificado con una secuencia peptídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 22. Utilización de un péptido purificado según la reivindicación 21, para aislar moléculas anti-VIH in vitro. 23. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que por lo menos un péptido está asociado de manera covalente o no covalente o está en una mezcla con un péptido extraño o un antígeno extraño. 39 ES 2 366 185 T3 ES 2 366 185 T3 41 ES 2 366 185 T3 42 ES 2 366 185 T3 43 ES 2 366 185 T3 44 ES 2 366 185 T3 ES 2 366 185 T3 46 ES 2 366 185 T3 47 ES 2 366 185 T3 48 ES 2 366 185 T3 49 ES 2 366 185 T3 ES 2 366 185 T3 51 ES 2 366 185 T3 52 ES 2 366 185 T3 53 ES 2 366 185 T3 54 ES 2 366 185 T3 ES 2 366 185 T3 56 ES 2 366 185 T3 57 ES 2 366 185 T3 58