Un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida,

que comprende las etapas de: a) poner en contacto defibrotida, plasmina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporciona un producto medible y b) medir la cantidad de producto formado a tiempos sucesivos, en el que el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula A1-A2-A3-X en la que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el producto medible, y en el que la concentración del sustrato para la plasmina es de 0,3 a 4, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferiblemente de 3 mM, caracterizado porque comprende las fases de: a') determinar la velocidad de liberación del producto medible X durante el transcurso de la reacción enzimática, para cada muestra de defibrotida, del tipo tanto patrón como de ensayo; b') correlacionar matemáticamente y/o gráficamente las velocidades de liberación mencionadas anteriormente con las concentraciones de defibrotida correspondientes; c') obtener las actividades biológicas de las muestras de ensayo de defibrotida

La presente invención se a refiere un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida y, más especialmente, se refiere a un método enzimático indirecto para determinar la actividad biológica de la defibrotida.

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La defibrotida (Índice Merck, 1996, Nº 2915) es una sustancia de origen natural que se obtiene por extracción a partir de órganos animales y que está constituida por la sal sódica de polidesoxirribonucleótidos que tienen un bajo peso molecular. La defibrotida ha sido objeto de numerosas investigaciones farmacológicas que han sugerido que se aplique en terapia como agente antitrombótico (documento US 3.829.567).

Además, la defibrotida se ha usado también con éxito en el tratamiento de arteriopatías periféricas, en la insuficiencia renal aguda (documento US 4.694.134)

o en la isquémica miocárdica aguda (documento US 4.693.995).

Como otras sustancias biológicas que se obtienen por extracción, la defibrotida también está sujeta a una variabilidad de composición limitada que es típica de biopolímeros naturales. Un ejemplo clásico de esta situación se proporciona por la heparina, cuya variabilidad de un lote a otro en términos de longitud de cadena, peso molecular, composición, grado de sulfatación, etc. es bien conocida. La consecuencia de esto es que las mismas cantidades en peso de defibrotida podrían de hecho no ser equivalentes desde el punto de vista de una actividad biológica específica.

El proceso de extracción, aislamiento y purificación no puede asegurar por sí mismo una reproducibilidad absoluta del producto, precisamente debido a su naturaleza biopolimérica intrínseca. Sin embargo, si se controla bien, es posible reducir esta variabilidad: con este fin, se han realizado estudios de procesos industriales normalizados para aislar defibrotida por extracción a partir de órganos, tales como, por ejemplo, los descritos en la Patente de Estados Unidos US

4.985.552.

El producto obtenido de acuerdo con el proceso mencionado anteriormente se caracteriza por la determinación de algunos parámetros físico-químicos específicos, tales como, por ejemplo, movilidad electroforética, el coeficiente de extinción, potencia rotatoria óptica e hipercromicidad reversible. Sin embargo, esos parámetros dependen básicamente de la estructura de la defibrotida y no pueden proporcionar información sobre la actividad biológica de la misma.

Hasta donde sabemos, los únicos métodos que se ha descrito que se han usado hasta ahora para evaluar la actividad biológica de la defibrotida son el ensayo de placas de fibrina y el registro tromboelastográfico del tiempo de lisis de euglobulina. [Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sull'attività fibrinolitica, nell'animale e nell'uomo, di una nuova sostanza presetite in diversi organi animali, Simposio Intemazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Roma, 2-4 Octubre 1975 -II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24.552-561). Sin embargo, los métodos mencionados anteriormente se caracterizan por una complejidad experimental considerable, por una reproducibilidad y una exactitud poco satisfactorias y, en el caso específico del registro tromboelastográfico, por un linealidad de respuesta limitada a intervalos de concentración muy limitados.

Hasta ahora, por lo tanto, no se ha conocido ningún método verdaderamente válido, exacto y reproducible para determinar la actividad biológica de la defibrotida.

El documento US-A-4 234 682 describe un método de determinación de la heparina usando un ensayo óptico basado en la escisión de un sustrato cromogénico por trombina.

Se ha desarrollado un método simple y fiable para determinar la actividad biológica de la defibrotida, que permite que se controlen las muestras obtenidas por extracción y, por lo tanto, permite que se normalicen las preparaciones medicinales basada en defibrotida.

El método al que se refiere la presente invención permite que se determine la actividad biológica específica de defibrotida en comparación con un patrón de referencia con un alto grado de exactitud, velocidad y reproducibilidad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere por lo tanto a un método para determinar la actividad biológica específica de muestras de defibrotida, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto defibrotida, plasmina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporcione un producto medible y

b) medir la cantidad de producto formado a tiempos sucesivos. en el que el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula

A1-A2-A3-X en la que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el producto medible, y en la que la concentración del sustrato para la plasmina es de 0,3 a 4, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferiblemente de 3 mM, caracterizado por que comprende las fases de:

a') determinar la velocidad de liberación del producto medible X durante el transcurso de la reacción enzimática para cada muestra de defibrotida, tanto del tipo patrón como de ensayo;

b') correlacionar matemáticamente y/o gráficamente las velocidades de liberación mencionadas anteriormente con las concentraciones de defibrotida correspondientes;

c') obtener las actividades biológicas de las muestras de ensayo de defibrotida.

El método de la invención es un método in vitro indirecto para determinar la

actividad de la defibrotida, que se basa en las interacciones funcionales entre la defibrotida y la plasmina.

Se sabe por la bibliografía que la plasmina es una enzima proteolítica en la cascada de la coagulación/fibrinolisis capaz de escindir la fibrina, el fibrinógeno y otras proteínas plasmáticas.

La actividad enzimática de la plasmina se determina normalmente por diversos ensayos in vitro convencionales. Uno de los métodos usados más comúnmente es la determinación por espectrofotometría o fluorimetría de los compuestos cromogénicos o fluorogénicos que se liberan por acción de la plasmina en sustratos adecuados [Haemostasis, (1978), 7, 138-145]. Se usan generalmente sustratos peptídicos que tienen la fórmula A1-A2-A3-X, en los que A1 y A2 son aminoácidos que son predominantemente no polares, A3 es lisina o arginina y X representa el compuesto liberado medible, por ejemplo, para-nitroanilina (pNa) o 2naftilamina (NA) [Haemostasis, (1978), 7, 146-149]. Además de los sustratos peptídicos mencionados anteriormente, se han logrado éxitos usando otros compuestos más simples tales como, por ejemplo, p-nitrobencil-p-toluenosulfonil-Larginina [Haemostasis, (1978), 7, 105-108].

En esos ensayos, la velocidad a la que se libera el compuesto X en el medio de incubación es proporcional a la actividad (Unidades Internacionales) de la plasmina presente en la muestra.

Se ha descubierto ahora, y este es el principio sobre el que se basa la presente invención, que en los ensayos de evaluación de plasmina descritos anteriormente, la defibrotida aumenta la velocidad de liberación de compuesto X de forma proporcional a su concentración. El método al que se refiere la presente invención hace posible, en primer lugar, poner en contacto entre sí la muestra de defibrotida, la plasmina y el sustrato para la plasmina.

La muestra de defibrotida usada para la determinación de acuerdo con la invención se prepara generalmente por extracción a partir de órganos de acuerdo con procedimientos conocidos, tal como se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos US 4.985.522 que ya se ha mencionado.

Se seleccionó un lote de defibrotida normal fabricada industrialmente como muestra de referencia (patrón) y se usó para preparar las curvas de calibración de acuerdo con el método de la presente invención.

En general, el presente método proporciona mediciones exactas y precisas de la defibrotida, incluso en presencia de contaminantes tales como, por ejemplo, ARN, heparina, defibrotida degradada (defibrotida de la que se ha eliminado purina

o pirimidina) o etanol, con tal de que estén en concentraciones generalmente inferiores al 10% en peso, de modo que no se altere el sistema.

Además de permitir la determinación de...

1. Un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto defibrotida, plasmina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporciona un producto medible y b) medir la cantidad de producto formado a tiempos sucesivos, en el que el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula

A1-A2-A3-X en la que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el producto medible, y en el que la concentración del sustrato para la plasmina es de 0,3 a 4, preferiblemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferiblemente de 3 mM, caracterizado porque comprende las fases de:

a') determinar la velocidad de liberación del producto medible X durante el transcurso de la reacción enzimática, para cada muestra de defibrotida, del tipo tanto patrón como de ensayo; b') correlacionar matemáticamente y/o gráficamente las velocidades de liberación mencionadas anteriormente con las concentraciones de defibrotida correspondientes; c') obtener las actividades biológicas de las muestras de ensayo de defibrotida.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la plasmina es una plasmina de mamífero, preferiblemente plasmina humana.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto medible X se selecciona de para-nitroanilina y 2-naftilamina.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sustrato para la plasmina es H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la plasmina tiene una concentración de 0,0064 a 0,050 U.I./ml y el sustrato para la plasmina tiene una

concentración de 2,5 a 3,5 mM.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la concentración de

plasmina es de 0,0125 U.I./ml y la concentración del sustrato para la plasmina es 3 5 mM.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el producto medible X se mide por espectrofotometría.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de reacción es una solución acuosa tamponada a un pH de 7 a 8, preferiblemente a pH 7,4.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la temperatura del 15 sistema se mantiene a de 35 a 39ºC, preferiblemente a 37ºC.