TÉCNICA DE PREPARACIÓN DE SUSPENSIÓN CELULAR Y USO DE LA MISMA.

Técnica de preparación de suspensión celular y uso de la misma Campo de la invención La presente invención se refiere a una sencilla, rápida y rentable técnica para injertar células y, en concreto, a un procedimiento para preparar una suspensión de células de una muestra de tejido obtenida de un sitio del donante y para aplicar dicha suspensión de células a un sitio del receptor. Técnica anterior ES 2 367 276 T3 Los expertos en la técnica conocen muchos procedimientos de tratar heridas. Por ejemplo, existen técnicas de injerto de piel cuyo objetivo es reconstruir la piel que cubre áreas del cuerpo en el que se han producido daños o defectos en la piel. En general, estos tipos de injertos se clasifican de acuerdo con su relación huésped-donante y por su espesor. El injerto más aplicado en la clínica es el injerto autólogo, en el que se extrae tejido de un área del cuerpo y se aplica en otra área. A continuación, el tejido injertado desarrolla un nuevo suministro de sangre y se une a los tejidos subyacentes. Hay varios tipos de injertos de piel que se usan actualmente, incluidos injertos espesor parcial y de espesor total y microinjerto. Cada uno de estos tipos de injerto debe prepararse usando ciertas técnicas, cada una de las cuales tiene sus ventajas y desventajas hereditarias. Los injertos de espesor dividido a menudo requieren una experiencia y tiempo considerables, además de un caro equipo. Además, los sitios para la donación son dolorosos, tienen como resultado la cicatrización y limitan el área que se va a cubrir. Aunque puede haber más éxitos que injertos de espesor total, normalmente son menos atractivos estéticamente. Los injertos de espesor total requieren menos experiencia y equipos menos caros y si aspecto estético es mejor que el de los injertos de espeso parcial. No obstante, los injertos de espesor total no cogen tan bien como los injertos de espesor parcial. Los microinjertos se consiguen con mayor facilidad y no requiere instrumentos especiales. No obstante, su aspecto estético no es tan bueno como el de otras técnicas, ya que la cicatriz resulta inaceptable. Una variación de las técnicas de injerto anteriores es el injerto de malla, que es un tipo de injerto de piel de espesor parcial o de espesor total en el que se hacen hileras paralelas de hendiduras en el tejido que se está tratando. Algunas de las ventanas de los injertos de malla incluyen: Una mayor cobertura del área afectada, drenaje de sangre o de suero desde debajo del injerto y mayor conformidad del injerto con las áreas no uniformes del receptor. Esta técnica ha tenido mucho éxito, con un 90 a 100 por cieno de enganche cuando los injertos se han aplicado sobre lechos de granulación sanos. Una alternativa al injerto de piel parcial es formar una ampolla bajo succión en un sitio del donante y transplantarlo al sitio del receptor. La producción de ampollas para tratar heridas se lleva usando desde la década de 1960. Las ampollas se producen con un dispositivo de succión, como Dermavac, a una presión de succión de aproximadamente 0,03-0,04 MPa durante 1-2 horas. A continuación se cortan las ampollas y se colocan sobre la herida. El tiempo de cicatrización es de aproximadamente 10-14 días. Este procedimiento tiene varias desventajas, tales como la cantidad de tiempo requerido para preparar el injerto es demasiado largo y el injerto puede no tener como resultado la repigmentación del área; o una pigmentación desigual es frecuente alrededor de los bordes del área de tratamiento. El microinjerto se ha convertido en el abordaje más habitual para cubrir un área grande e implica el recorte de una serie de secciones muy pequeñas de tejido de un lugar del donante y su aplicación a un vendaje, que, a su vez, se aplica en el área herida. La tecnología más avanzada para la generación de un tejido in vitro es cultivar epidermis. Los autoinjertos epiteliales cultivados (AEC) son un auxiliar importante en la cobertura de quemaduras y otras situaciones en las que áreas grandes de la superficie corporal experimentan pérdida de piel. Hay muchos centros de todo el mundo con instalaciones para cultivo tisular cuyo objetivo es producir injertos epiteliales autólogos para usar en una amplia variedad de aplicaciones. La utilidad y la aplicación de los AEC están relacionadas con su capacidad para conseguir láminas de células confluentes adecuadas para injertos. Esta técnica supera muchas de las desventajas de los tratamientos previos descritos con anterioridad. Por ejemplo, los autoinjertos epiteliales cultivados reducen la demanda de puntos del donante. No obstante, estos autoinjertos son de crecimiento lento y requieren tiempo para cultivar los injertos, lo que a menudo supera el tiempo de preparación de los puntos del receptor. La presente invención proporciona una suspensión celular junto con un procedimiento para preparar la suspensión y un dispositivo para su preparación, cada uno de los cuales busca mejorar una o más de las desventajas asociadas con la tecnología de injertos de la técnica anterior. 2 Resumen de la invención La invención objeto se refiere a un procedimiento para la preparación de una suspensión celular única, en el que el procedimiento rápido, eficiente y simple de preparar y aplicar. También se refiere a la suspensión celular única para usar en el tratamiento de pacientes que necesiten cirugía de injerto cutáneo. De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para preparar una suspensión celular adecuada para aplicar a un paciente, en el que el procedimiento es como se ha definido en la reivindicación 1 adjunta. En una forma preferida de la invención, el medio de disociación es de naturaleza química, tal como una enzima que es capaz de romper las uniones celulares, como, por ejemplo, tripsina. Además, preferentemente, la suspensión celular filtrada se diluye hasta una densidad celular adecuada usando una solución de nutrientes que puede ser cualquiera desde una solución de sales básicas hasta una solución de nutrientes más compleja. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona una suspensión celular producida de acuerdo con el procedimiento anterior para usar en el tratamiento de pacientes como se especifica adicionalmente en la reivindicación 7 adjunta. Preferentemente, las células en la suspensión son células autólogas (es decir, se aíslan del paciente que requiere un autoinjerto). Los inventores han observado que retirando suero xenogénico de la suspensión celular, existe menos probabilidad de transmisión de infección y se eliminan las reacciones xenogénicas entre un paciente y el suero. Otra característica de la suspensión celular producida de acuerdo con el procedimiento anterior es que la muestra de tejido usada para aislar las células en la suspensión se retira de la solución enzimática antes de recolectar las células. Cuando las células se exponen a las enzimas capaces de romper la adhesión intercelular, la viabilidad de la suspensión celular disminuye con el tiempo, de modo que se reduce la eficiencia del injerto cuando se aplica a un paciente. Se ha observado que la suspensión celular producida de acuerdo con el procedimiento anterior posee mayor viabilidad celular en comparación con los procedimientos comparativos que cosechan las células a intervalos regulares mientras el tejido está sumergido en presencia de enzimas como la tripsina. De acuerdo con un tercer aspecto de la invención se proporciona una suspensión celular para usar en el tratamiento de pacientes como se especifica adicionalmente en la reivindicación 9 adjunta. Descripción de las figuras La Figura 1 ilustra una vista en perspectiva del aparato usado para preparar la suspensión celular de acuerdo con la presente invención, con la tapa abierta y el segundo miembro en su sitio. La Figura 2 ilustra una vista en perspectiva del aparato usado para preparar la suspensión celular de acuerdo con la presente invención, con la tapa abierta y el segundo miembro retirado e invertido. La Figura 3a ilustra una vista en perspectiva del primer miembro del aparato usado para preparar la suspensión celular de acuerdo con la presente invención. La Figura 3b ilustra una vista en perspectiva desde atrás del primer miembro del aparato usado para preparar la suspensión celular de acuerdo con la presente invención. La Figura 4 ilustra una vista en perspectiva de la base del aparato usado para preparar la suspensión celular de acuerdo con la presente invención. Divulgación detallada de la invención A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entiende que la palabra "comprenden" o variaciones tales como comprende o que comprende implica la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados, pero no... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar una suspensión celular adecuada para la aplicación a un paciente, procedimiento que comprende las etapas de: (a) someter una muestra de tejido cutáneo, incluidas células adecuadas para injertar a un paciente, a al menos un medio de disociación física y/o química capaz de disociar el estrato celular en la muestra de tejido de piel durante tiempo suficiente para debilitar las fuerzas cohesivas entre el estrato tisular, en el que la muestra de tejido cutáneo comprende dermis, epidermis y unión dermis-epidermis entre ellas. (b) extraer la muestra de tejido cutáneo del medio de disociación usado en la etapa (a) y recolectar en presencia de una solución de nutrientes las células de la muestra de tejido cutáneo, las células adecuadas para injertar en un paciente, en el que la solución de nutrientes (i) carece de suero xenogénico, (ii) es capaz de mantener la viabilidad de las células hasta que se aplique a un paciente y (iii) es adecuada para la aplicación directa e una región de un paciente sometido a injerto tisular; y (c) filtrar la suspensión celular producida de acuerdo con la etapa (d) para eliminar conglomerados celulares grandes; en el que el procedimiento no comprende las etapas de sedimentar y resuspender las células. 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de disociación química es una enzima capaz de romper las uniones celulares. 3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la enzima es tripsina, tripsina-EDTA, enzima similar a la tripsina, dispasa, colagenasa, termolisina, pronasa, hialuronidasa, pancreatina, elastasa y/o papaína. 4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tiempo para debilitar las fuerzas cohesivas entre el estrato tisular de la etapa (a) es de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 60 minutos. 5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tiempo para debilitar las fuerzas cohesivas entre el estrato tisular de la etapa (a) es de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 20 minutos. 6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la solución de nutrientes es solución de Hartmann. 7. La suspensión celular obtenible mediante un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un paciente que necesite cirugía de injerto cutáneo, en la que la suspensión celular comprende células capaces de reproducirse, incluidas células basales queratinocitos, melanocitos y fibroblastos, en la que las células están en una proporción entre sí comparable con la observada in situ. 8. La suspensión celular para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la suspensión comprende células autólogas al paciente. 9. Una suspensión celular para su uso en el tratamiento de un paciente que necesite cirugía de injerto cutáneo, en la que la suspensión celular se prepara de acuerdo con las etapas siguientes: (a) someter una muestra de tejido cutáneo, incluidas células adecuadas para injertar a un paciente, a una enzima adecuada para disociar las piezas cohesivas del estrato tisular en la muestra de tejido cutáneo, en el que la muestra de tejido cutáneo comprende dermis, epidermis y unión dermis-epidermis entre ellas. (b) extraer la muestra de tejido cutáneo de la solución enzimática usada en la etapa (a) y recolectar en presencia de una solución de nutrientes las células de la muestra de tejido cutáneo, en la que las células son adecuadas para injertar a un paciente, en el que la solución de nutrientes (i) carece de suero xenogénico, (ii) es capaz de mantener la viabilidad de las células hasta que se aplique a un paciente y (iii) es adecuada para la aplicación directa e una región de un paciente sometido a injerto tisular. (c) filtrar la suspensión celular producida de acuerdo con la etapa (d) para eliminar conglomerados celulares grandes; en la que la suspensión celular comprende células capaces de reproducirse, incluidas células basales queratinocitos, melanocitos y fibroblastos, en la que las células están en una proporción entre sí comparable a la observada in situ. 12 ES 2 367 276 T3 10. La suspensión celular para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la solución de nutrientes es solución de Hartmann. 13 ES 2 367 276 T3 14 ES 2 367 276 T3 ES 2 367 276 T3 16 ES 2 367 276 T3 17