Un método para expresar in vitro un péptido funcional en una célula de insecto,

comprendiendo dicho método: a. proporcionar una construcción de ácido nucleico que incluya al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto que sea un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada, que sea una secuencia de señal de melitina; b. transfectar una célula de insecto con dicha construcción de ácido nucleico y c. cultivar dicha célula de insecto en condiciones que permitan la expresión del péptido NELL1.

Campo de la invención

La invención se refiere en líneas generales a un factor de crecimiento óseo y más particularmente a composiciones que incluyen NELL1, a productos de preparación que incluyen NELL1 y a métodos del uso de NELL1 para inducir la formación ósea. La presente invención también proporciona métodos para la expresión y purificación de péptidos NELL1 y NELL2.

Antecededentes de la invención

Los factores de crecimiento son sustancias, tales como péptidos, que influyen en el crecimiento y diferenciación de poblaciones de células definidas in vivo o in vitro. El documento WO 03/006483 describe la identificación de secuencias de aminoácidos de una forma de empalme de una proteína humana secretada que está relacionada con la subfamilia del factor de crecimiento epidérmico, así como variantes alélicas y otros ortólogos mamíferos de las mismas.

La formación ósea se produce durante el desarrollo de los huesos largos (formación ósea endocondral) y de los huesos planos (formación ósea intramembranosa). Adicionalmente, la formación ósea se produce durante la remodelación ósea que se produce de manera continua en la vida del adulto para mantener la integridad del esqueleto. Finalmente, la formación ósea se produce durante la reparación ósea, tal como cuando se producen lesiones óseas, por ejemplo, en una fractura o situación quirúrgica. Por otro lado, se piensa que los mecanismos de formación ósea individuales están implicados en el desarrollo embriológico de los huesos largos y planos y se piensa que la reparación está implicada en la formación ósea intramembranosa.

La formación ósea mediante cualquier mecanismo implica la actividad de osteoblastos, regulados por factores de crecimiento. Los osteoblastos derivan de un conjunto de células estromales medulares (conocidas también como células madre mesenquimales; MSC). Estas células están presentes en diversos tejidos y son frecuentes en el estroma medular. Las MSC son pluripotentes y pueden diferenciarse en una diversidad de tipos celulares que incluyen osteoblastos, condrocitos, fibroblastos, miocitos y adipocitos. Se piensa que los factores de crecimiento influyen en la proliferación celular osteogénica, diferenciación y mineralización de osteoblastos, cada una de las cuales influye en la formación ósea.

El hueso autógeno se ha usado, por ejemplo, tal como para la reparación ósea en pacientes con craneosinostosis e injerto leporino. La craneosinostosis (CS), el cierre prematuro de las suturas craneales, afecta a 1 de cada 3.000 recién nacidos y por lo tanto es una de las deformidades craneofaciales congénitas humana más comunes. El cierre prematuro de suturas produce dimorfismo craneal, lo que puede precisar corrección quirúrgica. El cierre prematuro de suturas en seres humanos con CS puede producirse mediante dos procesos posiblemente diferenciados: crecimiento excesivo de la calota craneal y fusión ósea. Recientemente, el FGF2 y el FGFR1 se han implicado en la fusión prematura de suturas craneales mediante rutas mediadas por el CBFA1 (8). La mutación de sentido erróneo del CBFA1 está asociada a displasia cleidocraneal, manifestada como cierre de sutura tardío.

Los procedimientos de injerto óseo autólogo se han realizado usando hueso autógeno, tal como procedente de la cresta iliaca o de la calota. Estos sitios donantes no están exentos de morbilidad asociada, que incluye dolor, molestias al caminar y parestesia en muslo, en caso de sitios donantes de cresta ilíaca e infección, déficits neurológicos y hematomas en caso de injertos de calota. Además, los sitios donantes pueden tener un volumen limitado y pueden contribuir a aumentar el tiempo de cirugía y la hospitalización.

También se han usado materiales de injerto aloplástico y se han ensayado factores de crecimiento en modelos animales. Por ejemplo, el bFGF ha mostrado potencial para su uso en regeneración y reparación ósea. Otra familia de factores de crecimiento osteogénico se ha descrito como proteína morfogénica ósea (BMP). Específicamente, se ha demostrado que la proteína BMP-2 recombinante regenera defectos de continuidad mandibular y defectos de paladar leporino con similares resultados o mejores a los del hueso autógeno particulado y médula ósea. Las BMP y otros factores osteogénicos se han estudiado para su uso en aplicaciones clínicas. Sin embargo, el coste del uso de dosificaciones mínimamente eficaces de las BMP ha sido un factor limitante en el uso clínico.

La fusión vertebral es una técnica quirúrgica en la que una o más de las vértebras de la médula espinal se unen entre sí de manera que entre ellas ya no se produce movimiento. Las recomendaciones incluyen: tratamiento de una vértebra fracturada (rota), corrección de deformidad, eliminación de dolor procedente del movimiento, tratamiento de inestabilidad y tratamiento de determinadas hernias discales cervicales. La cirugía puede implicar la colocación de un injerto óseo entre las vértebras para obtener una unión sólida entre ellas. El procedimiento también puede implicar tratamientos complementarios que incluyan la colocación de placas, tornillos, armaduras y recientemente la proteína morfogénica ósea 2 y 7 para ayudar a la estabilización y cicatrización del injerto óseo. El método clínicamente preferido ha sido el injerto óseo autógeno y sin embargo tiene aproximadamente una tasa de fracaso del 30-50%. El injerto óseo autógeno es una cirugía individual que también conduce a morbilidad significativa.

En el documento WO 03/006483 se ilustra un sistema de expresión de un péptido NELL. En Tessier D. C., y col., Gene, 98 (2): 177-183 (1991); LI, Y. y col., Virology, 204 (1): 266-278 (1994 ); y Sarkar M. y col., Glycoconjugate J, 15 (2): 193-197 (1998), se ilustra un sistema de producción de la proteína NELL no relevante usando una célula de insecto y un péptido de señal de secreción de insecto. Otra información relevante se documenta en WO 01/24821, Elkins, D.A., Rosi, J. Base de datos EMBL acceso Nº Q61220 (1997), Watanabe, T.K., y col., Genomics Academic Press, San Diego, 38 (3): 273-276 (1996), y Kuroda, S. y col., Biochemical and Biophysical Research Communications, 265 (3): 752-757 (1999).

Por lo tanto, se desean composiciones y métodos inocuos, eficaces y asequibles para inducir la formación ósea en el desarrollo óseo, trastornos o traumatismos óseos.

Sumario de la invención

La presente invención puede proporcionar métodos para la expresión y purificación de péptidos NELL1 y NELL2. En una realización, el método incluye péptidos NELL, construcciones de ácido nucleico que expresan péptidos NELL y células que expresan péptidos NELL que pueden ser útiles en la producción de cantidades de péptidos NELL. En una realización, las construcciones de ácido nucleico que expresan péptidos NELL pueden incluir adicionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos de señal que pueden facilitar el tránsito de proteínas y la modificación post producción de los péptidos NELL en la célula hospedadora. En una realización, el péptido de señal puede facilitar la secreción del péptido a partir de la célula hospedadora. Por lo tanto, la presente invención es ventajosa al menos proporcionando cantidades de péptidos NELL funcionales que pueden purificarse para uso clínico o en investigación.

La invención puede incluir composiciones y sustratos que incluyan péptidos NELL. En algunas realizaciones, una composición puede incluir NELL1 y puede incluir agentes adicionales que pueden efectuar la aplicación, estabilidad, actividad, difusión y/o concentración del péptido con respecto al sitio de aplicación, por ejemplo. En algunas realizaciones, un sustrato puede incluir células y/o péptidos NELL1 que puede facilitar la reparación ósea en las proximidades del implante.

La invención puede incluir métodos para inducir diferenciación osteogénica, mineralización osteoblástica y/o formación ósea en una diversidad de aplicaciones clínicas.

La presente invención es ventajosa al menos en que los péptidos NELL pueden proporcionar un mayor efecto al de los factores de crecimiento conocidos o pueden potenciar la actividad de otros factores de crecimiento. Por lo tanto, pueden usarse dosis inferiores de cada factor de crecimiento para aplicaciones clínicas. Esto es significativo al menos ya que los tratamientos clínicos pueden ser más asequibles. Adicionalmente la presente invención es ventajosa al menos ya que NELL1 potencia la diferenciación osteogénica, la mineralización... [Seguir leyendo]

1. Un método para expresar in vitro un péptido funcional en una célula de insecto, comprendiendo dicho método:

a. proporcionar una construcción de ácido nucleico que incluya al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto que sea un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada, que sea una secuencia de señal de melitina;

b. transfectar una célula de insecto con dicha construcción de ácido nucleico y

c. cultivar dicha célula de insecto en condiciones que permitan la expresión del péptido NELL1.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 que además comprende opcionalmente recoger el péptido NELL1 secretado a partir de la línea celular; o purificar sustancialmente el péptido NELL1, o ensayar la actividad del péptido NELL1, o ensayar la actividad del péptido NELL1 para inducir formación ósea.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha célula de insecto es una célula high five.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico que codifica NELL1 se selecciona del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3 y la SEC ID Nº: 5, seleccionándose la secuencia del péptido NELL1 del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 6.

5. Una construcción de ácido nucleico para expresar un péptido NELL1 en una célula de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

6. Una línea celular para expresar un péptido NELL1 funcional de acuerdo con las reivindicación 1 a 4, incluyendo dicha línea celular una construcción de ácido nucleico que comprenda al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL1 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

7. Un polipéptido que comprende un péptido NELL1 y un péptido de señal de secreción de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4.

8. Un método para expresar in vitro un péptido funcional en una célula de insecto, comprendiendo dicho método:

a. proporcionar una construcción de ácido nucleico que incluya al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL2 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto que es un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada, que es una secuencia señal de melitina;

b. transfectar una célula de insecto con dicha construcción de ácido nucleico y

c. cultivar dicha célula de insecto en condiciones que permitan la expresión del péptido NELL2.

9. El método de la reivindicación 8, que además comprende opcionalmente recoger el péptido NELL2 secretado a partir de la línea celular; o purificar sustancialmente el péptido NELL2, o ensayar la actividad del péptido NELL2, o ensayar la actividad del péptido NELL2 para inducir formación ósea.

10. El método de la reivindicación 8, en el que dicha célula de insecto es una célula high five.

11. El método de la reivindicación 8, en el que el ácido nucleico que codifica NELL2 se selecciona del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 11, y la SEC ID Nº: 13, seleccionándose la secuencia del péptido NELL2 del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº 12 y la SEC ID Nº: 14.

12. Una construcción de ácido nucleico para expresar un péptido NELL2 en una célula de insecto de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 11, comprendiendo dicha construcción de ácido nucleico al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL2 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

13. Una línea celular para expresar un péptido NELL2 funcional de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 11, incluyendo dicha línea celular una construcción de ácido nucleico que comprenda al menos un ácido nucleico que codifique al menos un péptido NELL2 en fase de lectura con un ácido nucleico que codifique un péptido de señal de secreción de insecto.

14. Un polipéptido que comprende un péptido NELL2 y un péptido de señal de secreción de insecto que es un péptido de señal de secreción procedente de una proteína de abeja secretada que es una secuencia de señal de melitina.

15. El polipéptido de la reivindicación 14, en el que el péptido NELL2 se selecciona del grupo que consiste en: la SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12 y la SEC ID Nº: 14.