Un glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, con propiedades inmunógenas,

para uso como un inmunógeno, que, en ausencia de un vehículo proteínico, es capaz de inducir anticuerpos IgG que reconocen células tumorales humanas, caracterizado porque: - comprende restos de carbohidratos que están O-enlazados directamente a un residuo de Ser o Thr enlazado a una cadena principal de apomucina, y porque - cada uno de los restos de carbohidratos que están O-enlazados directamente a un residuo de Ser o Thr de dicha cadena principal de apomucina es un resto GaINAc, y porque dicha cadena principal de apomucina comprende la secuencia de aminoácidos de: i. al menos una apomucina, y/o ii. al menos un fragmento de apomucina, en donde dicho al menos un fragmento comprende al menos una unidad repetitiva en tándem de apomucina, y en donde dicho al menos un fragmento tiene retenida dicha capacidad inducir IgG anti-tumoral, y/o iii. al menos un sub-fragmento de apomucina, en donde dicho al menos un sub-fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la unidad repetitiva en tándem de apomucina, y en donde dicho al menos un sub-fragmento tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral, y/o iv. al menos una variante conservada de de apomucina o de un fragmento como el definido en el apartado ii. en donde la secuencia de dicho al menos una variante conservada tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de dicha apomucina o fragmento, en la longitud completa de esta proteína o secuencia de fragmento, y en donde dicha al menos una variante conservada tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a glicoconjugados de mucina basados en el antígeno Tn, tales como glicoconjugados de mucina-Tn, mucina sTn, mucina-TF, y a un complejo inmunitario soluble que comprende dicho glicoconjugado de mucina basado en el antígeno Tn, para sus usos como inmunógenos, y a sus aplicaciones biológicas, farmacéuticas y médicas, más particularmente a sus aplicaciones en inmunología, notablemente en el campo del tratamiento paliativo, preventivo o terapéutico de tumores.

FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN

Las células malignas se expresan selectivamente en sus moléculas superficiales que tienen importancia funcional en la adherencia, invasión y metástasis celulares. Algunas de estas estructuras asociadas a tumores son el resultado de un bloqueo en la vía de glicosilación. En particular, el alargamiento incompleto de cadenas sacarídicas de Oglicano conduce a la expresión de estructuras de carbohidratos más cortas, tales como los antígenos Tn, sialil-Tn o TF (Hollingsworth and Swanson 2004). El antígeno Tn, definido como una unidad GaINAc -enlazada a un residuo de serina o treonina (-GaINAc-O-Ser/Thr), es una de las estructuras asociadas a tumores humanas más específicas. El antígeno Tn se detecta en aproximadamente 90% de los carcinomas humanos (Springer 1984) y su expresión está correlacionada con la agresividad de los carcinomas (Springer 1997). Por otra parte, en condiciones apropiadas, el antígeno Tn es capaz de inducir una fuerte respuesta inmunitaria en ratones y primates no humanos, siendo los anticuerpos resultantes capaces de reconocer células cancerígenas humanas (Lo-Man et al., 2001, Lo-Man et al., 2004).

Este epítopo O-enlazado se expresa generalmente en mucinas como sus estructuras nucleares de carbohidratos (Hollingsworth and Swanson 2004). Las mucinas son proteínas O-glicosiladas de alto peso molecular (50-80% de sus masas es debida a las cadenas de carbohidratos O-enlazadas) que participan en la protección, lubricación y resistencia a los ácidos de la superficie epitelial (Gendler and Spicer 1995). Hasta la fecha, se han identificado y numerado en orden cronológico de su descripción diferentes mucinas (MUC1-MUC20) (Chen et al., 2004, Filshie et al., 1998, Gum et al., 2002, Higuchi et al., 2004, Moniaux et al., 2001, Pallesen et al., 2002, Williams et al., 2001, Yin and Lloyd 2001). Aunque no muestran homología de secuencias, todas las mucinas presentan una región grande compuesta de un número variable de unidades repetitivas en tándem (VNTR, del inglés Variable Number of Tandem Repeats). Estas regiones, denominadas generalmente unidades repetitivas de secuencias en tándem, se caracterizan por un alto contenido en residuos de serina, treonina (que constituyen los sitios potenciales de Oglicosilación) y prolina.

Cada órgano o tejido presenta un único modelo de expresión de los genes MUC (Gendler and Spicer 1995). Este perfil de la expresión de las mucinas se puede modificar en condiciones patológicas y especialmente durante la transformación maligna. La sobre-regulación, la sub-regulación y la expresión de novo de las proteínas mucinas han sido descritas en células epiteliales cancerígenas y se sabe que influyen en la adherencia celular (Hilkens et al. 1992) y que contribuyen a la capacidad invasiva de los tumores (Segal-Eiras and Croce 1997). Por otra parte, estas mucinas asociadas a tumores presentan diferencias antigénicas con las mucinas normales y son altamente inmunógenas y en este sentido pueden usarse como dianas potenciales para inmunoterapia (Agrawal et al. 1998, Apostolopoulos et al. 1996). En particular, la MUC1 está siendo sometida a diversas pruebas clínicas como vacuna anti-cancerígena (Finn et al. 1995, Gilewski et al. 2000).

La MUC6 fue aislada primeramente de una genoteca humana de estómago (Toribara et al., 1993) y se expresa a altos niveles en el estómago normal y en la vesícula biliar con expresión más débil en el íleo terminal, colon derecho y en el endo-cuello del útero (De Bolos et al., 1995, Ho et al. 1995, Reis et al., 2000, Toribara et al., 1993). La MUC6 tiene una unidad repetitiva en tándem de 169 aminoácidos (507 pb cada uno) (Toribara et al., 1993) y los análisis por transferencia Southern de los alelos más cortos de MUC6 indican que contienen al menos 15 unidades repetitivas (Vinall et al., 1998). Aunque el gen completo de MUC6 ha sido localizado e identificado, todavía no se ha secuenciado completamente un cDNA de longitud completa (Rousseau et al., 2004). Además de su expresión normal en los tejidos gástricos, la MUC6 ha sido detectada en el adenocarcinoma y la metaplasia de Barrett (Guillem et al., 2000), en el adenoma y carcinoma intestinal (Guillem et al., 2000), en el carcinoma pulmonar (Hamamoto et al., 2005, Nishiumi et al. 2003), en pólipos colorrectales (Bartman et al., 1999) y en carcinoma de mama (De Bolos et al., 1995, Pereira et al., 2001), mientras que no se expresa en los tejidos normales respectivos. En algunos casos, se ha observado que la expresión de MUC6 está correlacionada con los grados de histopatología relacionada con la potencial malignidad (Bartman et al., 1999, Hamamoto et al., 2005, Nishiumi et al., 2003). Los inventores de la presente solicitud han demostrado recientemente que la MUC6 está anómalamente glicosilada en las células del cáncer de mama MCF7 puesto que contiene el antígeno Tn (Freire et al., 2005). Diversos estudios han demostrado que las estructuras de carbohidratos de las mucinas (incluyendo el antígeno Tn del núcleo) pueden ser esenciales para la definición de las estructuras asociadas a tumores (Grinstead et al., 2003, von Mensdorff-Pouilly et al., 2005). Por consiguiente, los glicoconjugados Tn-MUC6 representan dianas atractivas para ser utilizadas en la inmunoterapia del cáncer. Una respuesta del anticuerpos anti-Tn específicos debe dirigirse a las células cancerígenas a través del antígeno Tn, que se expresa en sus superficies. Además, se debe favorecer la activación de los linfocitos T citotóxicos específicos de las mucinas a través de la absorción de complejos inmunitarios MUC6Tn solubles por receptores Fc en células dendríticas (Amigorena and Bonnerot 1999).

**(Ver fórmula)**

Sin embargo las técnicas anteriores adolecen del inconveniente de no permitir una producción fácil de glicoconjugados de mucina-Tn.

Los glicoconjugados de mucina-Tn son:

- glicoconjugados que existen en la naturaleza o

- glicopéptidos sintéticos.

Los glicoconjugados mucina-Tn que existen en la naturaleza se obtienen por aislamiento a partir de una fuente biológica (Podolsky 1985; Robbe et al., 2004). Dichos glicoconjugados se pueden obtener sólo en muy pequeñas cantidades. Su cadena principal de apomucina es una proteína completa de apomucina, que lleva un gran número de diferentes residuos de carbohidratos. Los glicoconjugados mucina-Tn que existen en la naturaleza no sólo contienen antígenos Tn, sTn y TF, sino también un gran número de otros residuos de carbohidratos, cuya naturaleza varía dependiendo del tipo, condición y estado de la célula de la que proceden.

La preparación de glicoconjugados antigénicos que existen en la naturaleza implica además purificaciones tediosas en múltiples etapas y/o que consumen tiempo.

Otros glicoconjugados mucina-Tn de la técnica anterior son los glicopéptidos sintéticos mucina-Tn. Su cadena principal de apomucina está limitada a unos cuantos aminoácidos.

Por ejemplo, Kagan et al., 2005 describen conjugados KHL de glicopéptidos de MUC1 o MUC2. La cadena principal peptídica de estos conjugados de KHL es un péptido de 32 aa de MUC1 o MUC2 y la(s) enzima(s) utilizada(s) para glicosilar estos péptidos es(son) N-acetilgalactosaminiltransferasa(s) T2 y/o T4.

Dichos glicopéptidos de la técnica anterior, cuando se utilizan solos, no son muy eficaces en inducir una respuesta inmunitaria: requieren ser conjugados a un vehículo proteínico, tal como KLH, para ejercer sus propiedades antigénicas, si las tienen. Como consecuencia, los glicopéptidos derivados de mucina utilizados como inmunógenos son de hecho conjugados con KLH.

Otros glicopéptidos de mucina sintéticos han sido descritos por los inventores de la presente solicitud, en Freire et al., 2005 (Cancer Res. 65(17): 7880-7887).

Freire et al. 2005 describen la producción de un glicopéptido MUC6-Tn (GTTPPPTTLK; SEQ ID NO:14) y de los glicopéptidos MUC1-Tn, MUC2-Tn y MUC5B-Tn. La cadena principal de apomucina de estos glicoconjugados de mucina-Tn... [Seguir leyendo]

1. Un glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, con propiedades inmunógenas, para uso como un inmunógeno, que, en ausencia de un vehículo proteínico, es capaz de inducir anticuerpos IgG que reconocen células tumorales humanas, caracterizado porque:

 comprende restos de carbohidratos que están O-enlazados directamente a un residuo de Ser o Thr enlazado a una cadena principal de apomucina, y porque

 cada uno de los restos de carbohidratos que están O-enlazados directamente a un residuo de Ser o Thr de dicha cadena principal de apomucina es un resto GaINAc, y porque dicha cadena principal de apomucina comprende la secuencia de aminoácidos de:

i. al menos una apomucina, y/o

ii. al menos un fragmento de apomucina, en donde dicho al menos un fragmento comprende al menos una unidad repetitiva en tándem de apomucina, y en donde dicho al menos un fragmento tiene retenida dicha capacidad inducir IgG anti-tumoral, y/o

iii. al menos un sub-fragmento de apomucina, en donde dicho al menos un sub-fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la unidad repetitiva en tándem de apomucina, y en donde dicho al menos un sub-fragmento tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral, y/o

iv. al menos una variante conservada de de apomucina o de un fragmento como el definido en el apartado ii. en donde la secuencia de dicho al menos una variante conservada tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de dicha apomucina o fragmento, en la longitud completa de esta proteína o secuencia de fragmento, y en donde dicha al menos una variante conservada tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral.

2. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC6.

3. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 2, caracterizado porque dicha proteína apomucina MUC6 comprende una secuencia de unidad repetitiva en tándem de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:15.

4. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 2 o 3, caracterizado porque dicho al menos un sub-fragmento, como se ha definido en el apartado iii. de la reivindicación 1, comprende al menos 85 aminoácidos contiguos de dicha unidad repetitiva en tándem de apomucina.

5. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC3.

6. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha apomucina es a MUC4 apomucina.

7. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC5.

8. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno de la reivindicación 7, caracterizado porque dicha MUC5 apomucina es una apomucina MUC5AC.

9. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicho al menos un sub-fragmento definido en el apartado iii. de la reivindicación 1 comprende al menos 20 aminoácidos contiguos de dicha unidad repetitiva en tándem.

10. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho al menos un sub-fragmento, como el definido en el apartado iii. de la reivindicación 1, tiene retenido al menos un epítopo de CTL.

11. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 10, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC6, y porque la secuencia de dicho al menos un epítopo de CTL es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-23.

12. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque al menos 40% de los residuos de Ser y Thr contenidos en dicha cadena principal de apomucina están O-enlazados directamente a un residuo de GaINAc.

13. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende además al menos un resto de carbohidrato enlazado a al menos uno

de los restos de GaINAc O-enlazados.

14. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 13, caracterizado porque dicho al menos un resto de carbohidrato enlazado a GaINAc es un resto de GaINAc, un grupo sialilo o un resto de galactosa.

15. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicha cadena principal de apomucina comprende la secuencia de:

**(Ver fórmula)**

- al menos dos apomucinas, y/o

- al menos dos fragmentos como se los definidos en el apartado ii., de la reivindicación 1, y/o

- al menos dos sub-fragmentos como el definido en el apartado iii., de la reivindicación 1, y/o

- al menos una apomucina, y al menos un fragmento como el definido en el apartado ii., de la reivindicación 1, y/o

- al menos una apomucina, y al menos un sub-fragmento como el definido en el apartado iii., de la reivindicación 1, y/o

- al menos un fragmento como el definido en el apartado ii., de la reivindicación 1, y al menos un sub-fragmento como el definido en el apartado iii., de la reivindicación 1.

16. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno de la reivindicación 15, caracterizado porque cada uno de dichos al menos dos fragmentos, y/o de dichos al menos dos sub-fragmentos, y/o de dicho al menos un fragmento y al menos un sub-fragmento, contenido en dicha cadena principal de apomucina, es un fragmento o sub-fragmento, de una apomucina diferente.

17. El glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de la reivindicación 15 o 16, caracterizado porque la secuencia de cada uno de dichos al menos dos fragmentos es la secuencia de la unidad repetitiva en tándem de una proteína apomucina.

18. Un complejo inmunitario soluble, para uso como un inmunógeno, que comprende:

- al menos glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, y

- al menos una estructura de inmunoglobulina o al menos un fragmento de inmunoglobulina que es un fragmento Fc, un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)'2, una cadena ligera o una cadena pesada.

19. Un proceso para la producción in vitro de una composición inmunógena, caracterizado porque dicho proceso comprende la producción in vitro de un glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno que, en ausencia de un vehículo proteínico, puede inducir anticuerpos IgG que reconocen células tumorales humanas, permitiendo dicho proceso facilitar la producción de dicho glicoconjugado en al menos cantidades escala semi-preparativa, en donde proceso comprende transferir in vitro al menos una N-acetilgalactosamina (GaINAc) a al menos un residuo de Ser o Thr de una cadena principal de apomucina,

en donde dicha cadena principal de apomucina comprende la secuencia de aminoácidos de:

i. al menos una apomucina, y/o

ii. al menos un fragmento de apomucina, en donde dicho al menos un fragmento comprende al menos una unidad repetitiva en tándem, y en donde dicho al menos un fragmento tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral, y/o

iii. al menos un sub-fragmento de apomucina, en donde dicho al menos un sub-fragmento comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la unidad repetitiva en tándem, y en donde dicho al menos un sub-fragmento tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral, y/o

iv. al menos una variante conservada de una apomucina o de un fragmento como el definido en el apartado

ii. en donde la secuencia de dicho al menos una variante conservada tiene al menos 70% de identidad con la secuencia de dicha apomucina o fragmento, en la longitud total de esta secuencia de proteína o fragmento, y en donde dicha al menos una variante conservada tiene retenida dicha capacidad de inducir IgG anti-tumoral,

y en donde dicha transferencia in vitro es una transferencia que se realiza enzimáticamente usando al menos una UDP-N-acetilgalactosamina:polipéptido-N-acetilgalactosaminiltransferasa (ppGalNAc-T).

20. El proceso de la reivindicación 19, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC6.

21. El proceso de la reivindicación 19, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC3.

22. El proceso de la reivindicación 19, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC4.

23. El proceso de la reivindicación 19, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC5.

24. El proceso de la reivindicación 23, caracterizado porque dicha apomucina es una apomucina MUC5AC.

25. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-24, caracterizado porque dicho al menos un sub-fragmento, como el definido en el apartado iii. de la reivindicación 19, comprende al menos 20 aminoácidos contiguos de dicha unidad repetitiva en tándem.

26. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-25, caracterizado porque dicha al menos una ppGaINAc-T es proporcionada disponiendo de un extracto que contiene enzimas de una célula cancerosa.

27. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-26, caracterizado porque dicha al menos una ppGaINAc-T es una ppGaINAc-T1, ppGaINAc-T3, ppGaINAc-T6, ppGaINAc-T7, ppGaINAc-T13

28. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-27, caracterizado porque dicha transferencia de GaINAc es monitorizada por espectroscopía de masas SELDI-TOF.

29. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-28, caracterizado porque dicho glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno, se purifica de la mezcla de reacción.

30. Un glicoconjugado de mucina basado en Tn, para uso como un inmunógeno, caracterizado porque se obtiene por el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 19-29, y porque al menos 40% de número total de residuos de Ser y Thr contenidos en su cadena principal de apomucina están O-enlazados directamente a un resto de GaINAc

31. Una composición, para uso como una composición inmunógena, que comprende:

- al menos un glicoconjugado de mucina, basado en el antígeno Tn, inmunógeno como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o 30, y/o

- al menos un complejo inmunitario soluble como se ha definido en la reivindicación 18.

32. La composición inmunógena de la reivindicación 31, caracterizada porque es una vacuna anti-tumoral.

33. La composición de la reivindicación 31 o 32, caracterizada porque comprende además al menos un vehículo farmacéuticamente y/o fisiológicamente aceptable.