QUÍMICA DE CLICK PARA LA PRODUCCIÓN DE MOLÉCULAS INFORMADORAS.

Un método para producir una molécula informadora que comprende al menos dos grupos funcionales diferentes,

que comprende (a) sintetizar la molécula informadora a partir de una pluralidad de bloques de construcción, en el que al menos un bloque de construcción comprende un primer grupo asidero que es un grupo alquino o un grupo alquino protegido, en el que al menos un grupo de construcción comprende un segundo grupo asidero que es un grupo alquino protegido, y en el que el primer grupo asidero es diferente del segundo grupo asidero; (b) acoplar una primera pareja de reacción al primer grupo asidero en condiciones en las que el primer grupo asidero es reactivo y el segundo grupo asidero no es reactivo, en el que la primera pareja de reacción comprende un primer grupo funcional, y subsiguientemente (c) acoplar una segunda pareja de reacción al segundo grupo asidero, en el que la segunda pareja de reacción comprende un segundo grupo funcional, y en el que el primer grupo funcional es diferente del segundo grupo funcional, en el que la molécula informadora se selecciona de ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos, en el que una pareja de reacción que comprende un grupo azida se acopla a un grupo alquino vía reacción de click, en el que la síntesis de la molécula informadora es una síntesis química en fase sólida en la que la molécula informadora se sintetiza mediante ensamblaje por etapas de bloques de construcción mientras está unida a una fase sólida, y en la que al menos la primera pareja de reacción se acopla mientras que la molécula informadora está unida a la fase sólida, y en el que el grupo alquino protegido es un alquino protegido con tris (alquil/aril) sililo.

Química de click para la producción de moléculas informadoras La presente invención se refiere a métodos para producir moléculas informadoras adecuadas para la detección de analitos, por ejemplo ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención Los avances de referencia del campo de la síntesis de ADN, de forma muy importante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la química de fosforamiditos, han conducido a un repertorio creciente de modificaciones de ADN natural. En la PCR, los trifosfatos de nucleósidos modificados, que poseen un ligador en la posición 5 de pirimidinas o en la posición 7 de 7-desazapurinas, se puede incorporar usando ciertas polimerasas de la Familia B [1]. La facilidad de incorporación de estos bloques de construcción en el ADN depende fuertemente del volumen estérico y de la estructura molecular de la cadena lateral. En principio, las cuatro nucleobases de origen natural se pueden sustituir por aquellas modificadas en una PCR [2]. Si se emplea la química de fosforamiditos, en principio se puede incorporar en el ADN cualquier estructura molecular. La mayor limitación es que las nucleobases modificadas que se incorporan en el ADN deben ser estables con respecto a las condiciones de la síntesis de ADN mediante fosforamiditos y la desprotección de la hebra de ADN resultante.

En nuestro grupo [3] se ha desarrollado un enfoque que soslaya tanto los problemas del volumen estérico como la labilidad química potencial de las modificaciones. Los nucleótidos modificados poseen un ligador que contiene un alquino interno y un alquino terminal. El alquino interno facilita la incorporación vía PCR, ya que se minimiza el volumen estérico en estrecha proximidad a la nucleobase. El alquino terminal es un sitio reactivo para la reacción de click [4], que es una cicloadición dipolar de Huisgen, catalizada por cobre, entre azidas y alquinos [5]. Esta reacción se puede usar convenientemente para el marcaje post-sintético de biomoléculas. Las azidas se pueden unir así a ADN en una reacción de alto rendimiento sin encontrar reacciones secundarias significativas, ya que las biomoléculas no poseen azidas o alquinos terminales. Este enfoque también se describe en el documento PCT/EP2006/004017. Géci et al. (Bioconjugate Chem., 2006, 17, 950-957) describe oligonucleótidos que tienen una inserción que presenta un grupo alquino. No se describe la post-modificación del grupo alquino con una molécula que contiene azida (reacción de click) .

Según procedimientos descritos previamente, sólo se puede introducir un único tipo de grupo marcador de una manera selectiva del sitio.

Aucagne et al. (Organic Letters, 2006, vol. 8, nº 20) describen “llevar a cabo una reacción de click” regioespecífica sucesiva de un dipéptido con análogos dipeptídicos en una síntesis de una cazuela bajo formación de dos enlaces triazólicos.

Allí, un tripéptido se funcionaliza de forma terminal tanto con un grupo alquino como con un grupo alquino sililado, y después se hace reaccionar sucesivamente con análogos dipeptídicos que contienen azida.

De este modo, fue un objeto de la presente invención superar esta limitación y permitir el marcado, específico del sitio, de moléculas informadoras con al menos dos grupos marcadores diferentes, por ejemplo colorantes u otras moléculas funcionales, de manera consecutiva, llevando a cabo de ese modo una versatilidad sin precedentes en la modificación.

Sumario de la invención La presente invención permite la incorporación específica del sitio de dos o más grupos funcionales diferentes en una molécula informadora, de manera consecutiva. Esto se logra incorporando al menos dos grupos asidero diferentes en la molécula informadora durante su síntesis, que se puede acoplar selectivamente a parejas de reacción que comprenden grupos funcionales diferentes.

La presente invención se refiere a un método para producir una molécula informadora que comprende al menos dos grupos funcionales diferentes, que comprende

(a) sintetizar la molécula informadora a partir de una pluralidad de bloques de construcción, en el que al menos un bloque de construcción comprende un primer grupo asidero que es un grupo alquino o un grupo alquino protegido, en el que al menos un grupo de construcción comprende un segundo grupo asidero que es un grupo alquino protegido, y en el que el primer grupo asidero es diferente del segundo grupo asidero;

(b) acoplar una primera pareja de reacción al primer grupo asidero en condiciones en las que el primer grupo asidero es reactivo y el segundo grupo asidero no es reactivo, en el que la primera pareja de reacción comprende un primer grupo funcional, y subsiguientemente

(c) acoplar una segunda pareja de reacción al segundo grupo asidero, en el que la segunda pareja de

reacción comprende un segundo grupo funcional, y en el que el primer grupo funcional es diferente del segundo grupo funcional, en el que la molécula informadora se selecciona de ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos, en el que una pareja de reacción que comprende un grupo azida se acopla a un grupo alquino vía reacción de click, en el que la síntesis de la molécula informadora es una síntesis química en fase sólida en la que la molécula informadora se sintetiza mediante ensamblaje por etapas de bloques de construcción mientras está unida a una fase sólida y en la que al menos la primera pareja de reacción se acopla mientras que la molécula informadora está unida a la fase sólida, y en el que el grupo alquino protegido es un alquino protegido con tris (alquil/aril) sililo. Se describe un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas:

(a) proporcionar una muestra;

(b) poner en contacto la muestra con una molécula informadora que comprende al menos dos grupos funcionales diferentes, en el que los grupos funcionales están unidos a la molécula informadora vía grupos ligadores que comprenden anillos de 1, 2, 3-triazol, y

(c) detectar una interacción de la molécula informadora con el analito, lo que es indicativo de la presencia y/o

la cantidad de analito en la muestra. Además, se describe una molécula receptora que comprende al menos dos grupos funcionales diferentes, en la que los grupos funcionales están unidos a la molécula informadora vía grupos ligadores que comprenden anillos de 1, 2, 3-triazol.

Un aspecto adicional de la invención es un compuesto de la Fórmula (I)

C-S-N en la que C es un grupo alquino protegido, S es un espaciador o un enlace, y N es un bloque de construcción nucleotídico, en el que el grupo alquino protegido es un alquino protegido con tris (alquil/aril) sililo. Adicionalmente, se describe un compuesto de la Fórmula (II)

B-S-N3 en la que B es biotina o un derivado de biotina, tal como destiobiotina o aminobiotina, S es un espaciador o un enlace, y N3 es un grupo azida. Se describe un compuesto de la Fórmula (III)

Q-S-N en la que Q es un grupo con fluorescencia apagada, S es un espaciador o un enlace, y N es un grupo azida. Adicionalmente, se describe un compuesto de la Fórmula (IV)

Z-S-N en la que Z es un grupo aldosa, en el que los grupos hidroxi están protegidos con grupos acilo y/o sililo, o un grupo 1, 2-diol protegido o no protegido, S es un espaciador o un enlace, y N es un bloque de construcción de ácido nucleico o análogo de ácido nucleico, tal como un compuesto nucleosídico o nucleotídico.

Además, se describe un compuesto de la Fórmula (V)

D-S-N

en la que D es un colorante de infrarrojos (IR) , S es un espaciador o un enlace, y N es un grupo azida.

Los compuestos de las Fórmulas (I) - (V) son adecuados como reactivos en métodos para detectar analitos, particularmente mediante métodos fotográficos como se describe más abajo en detalle.

La presente invención permite una producción eficiente de moléculas informadoras que comprenden dos, tres o más grupos funcionales diferentes. Estas moléculas informadoras permiten una detección altamente sensible de un analito, por ejemplo ácidos nucleicos o proteínas que se unen a ácidos nucleicos, en muestras biológicas, por ejemplo muestras clínicas, muestras medioambientales o muestras agrícolas. Las aplicaciones preferidas incluyen, pero no se limitan a, la detección de variabilidades genéticas, por ejemplo polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) , resistencias a plaguicidas o a medicamentos, tolerancias o intolerancias, genotipado, por ejemplo la detección... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una molécula informadora que comprende al menos dos grupos funcionales diferentes, que comprende

(a) sintetizar la molécula informadora a partir de una pluralidad de bloques de construcción, en el que al menos un bloque de construcción comprende un primer grupo asidero que es un grupo alquino o un grupo alquino protegido, en el que al menos un grupo de construcción comprende un segundo grupo asidero que es un grupo alquino protegido, y en el que el primer grupo asidero es diferente del segundo grupo asidero;

(b) acoplar una primera pareja de reacción al primer grupo asidero en condiciones en las que el primer grupo asidero es reactivo y el segundo grupo asidero no es reactivo, en el que la primera pareja de reacción comprende un primer grupo funcional, y subsiguientemente

(c) acoplar una segunda pareja de reacción al segundo grupo asidero, en el que la segunda pareja de reacción comprende un segundo grupo funcional, y en el que el primer grupo funcional es diferente del segundo grupo funcional,

en el que la molécula informadora se selecciona de ácidos nucleicos y análogos de ácidos nucleicos, en el que una pareja de reacción que comprende un grupo azida se acopla a un grupo alquino vía reacción de click, en el que la síntesis de la molécula informadora es una síntesis química en fase sólida en la que la molécula informadora se sintetiza mediante ensamblaje por etapas de bloques de construcción mientras está unida a una fase sólida, y en la que al menos la primera pareja de reacción se acopla mientras que la molécula informadora está unida a la fase sólida, y en el que el grupo alquino protegido es un alquino protegido con tris (alquil/aril) sililo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que

(i) la molécula informadora comprende hasta 2000 bloques de construcción, y/o

(ii) los grupos funcionales se seleccionan de grupos marcadores, grupos extintores y grupos de unión.

3. El método de la reivindicación 2, en el que los grupos marcadores son colorantes.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el primer y el segundo grupo funcional son un grupo marcador y un grupo extintor, o en el que el primer y el segundo grupo funcional son un grupo marcador y un grupo de unión.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la primera pareja de reacción se acopla al primer grupo asidero en condiciones en las que el primer grupo asidero está sin proteger y el segundo grupo asidero está protegido.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que se incorporan en la molécula informadora al menos tres grupos asidero.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el primer grupo asidero es un grupo alquino, y el segundo y tercer grupos asidero son grupos alquino protegidos que poseen diferentes grupos de protección.

8. Un compuesto de la Fórmula (I)

C-S-N en la que C es un grupo alquino protegido, S es un espaciador o un enlace, y N es un bloque de construcción nucleotídico, en la que el grupo alquino protegido es un grupo alquino protegido con tris (alquil/aril) sililo.