Un procedimiento de la purificación de antitrombina-III, que comprende las etapas de:

(a) añadir, a una solución que comprende antitrombina-III, un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v) y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, para precipitar las impurezas; (b) dejar que las impurezas precipiten; y (c) retirar las impurezas precipitadas obteniendo, de esta manera, una solución que comprende antitrombina-III purificada

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a procedimientos para la purificación de antitrombina-III (AT-III) por precipitación de impurezas.

TÉCNICA ANTERIOR

La antitrombina III (AT-III) es una glicoproteína del plasma que inhibe las serina proteasas en la cascada de coagulación y, de esta manera, desempeña un papel fundamental en la regulación de la coagulación sanguínea. Una pequeña disminución en el contenido de AT-III en la sangre está asociada con un mayor riesgo de tromboembolia. Los concentrados de AT-III se usan en la profilaxis y tratamiento de trastornos tromboembólicos en pacientes con deficiencia de antitrombina, adquirida o hereditaria.

Generalmente, la AT-III se aísla del plasma humano y se administra al torrente circulatorio del paciente. En consecuencia, es deseable la inactivación con virus de los concentrados de AT-III. La precipitación con polietilenglicol (PEG) se ha usado ampliamente en la purificación de AT-III, para concentrar la proteína y para precipitar los virus (véase, por ejemplo Wickerhauser et al. (1979) Vox Sanguinis 36, 281). Además de PEG, también se han usado sulfato de bario, etanol, ácido tricloroacético, dextrano y sulfato amónico, como agentes de precipitación durante la purificación de AT-III. Muchos de estos agentes de precipitación serían dañinos si estuvieran presentes en la formulación de AT-III final. En consecuencia, es necesaria la retirada posterior de estos agentes, y la recuperación de AT-III, por lo tanto, se reduce.

La precipitación con PEG solo no es suficiente para asegurar la retirada completa del virus de la hepatitis. Los concentrados de AT-III para uso terapéutico, por lo tanto, normalmente se pasteurizan, normalmente a +60ºC, durante 10 h. En general, las proteínas del plasma pierden su actividad durante el tratamiento térmico. Por esta razón, se usan agentes estabilizadores durante la pasteurización.

El citrato y los carbohidratos, tales como sacarosa, se han usado como agentes estabilizadores para AT-III durante la pasteurización (Mitra et al. (1982) Biotechnology and Bioengineering vol. XXIV, 97-107; Tengborn et al. (1987) Thrombosis Research 48, 701-711; Einarsson et al. (1989) Transfusion 29, 148-152). Sin embargo, en estos documentos, no se indica que el citrato y los sacáridos puedan usarse como agentes de precipitación en la purificación de AT-III.

Como una etapa final en la purificación de AT-III, la formulación a menudo se liofiliza. Se han hecho muchos intentos para prolongar el periodo de validez de la ATIII liofilizada.

El documento US 4.340.589 (Uemura et al.) desvela una preparación liofilizada de AT-III, estabilizada con al menos una sustancia seleccionada entre aminoácidos, sacáridos, polisacáridos, etc., más específicamente albúmina, urocinasa, gelatina, manitol, heparina, glicina y lisina.

Ashizawa et al. (Solicitud de Patente Japonesa Nº 1994-199566) dan a conocer preparaciones liofilizadas de AT-III estabilizada, modificada con uno o más elementos seleccionados entre sales de ácido orgánico, sacáridos, aminoácidos y cloruro sódico. Dichas sales orgánicas podrían ser succinato sódico o citrato sódico. Dichos sacáridos podrían ser D-manitol, lactosa, glucosa y D-sorbitol. No hay indicación en este documento de preparaciones de AT-III liofilizadas que comprendan citrato junto con sacarosa.

El documento WO 94/26287 dan a conocer un procedimiento para reducir la concentración de compuestos químicos inactivantes de virus y/o detergentes en una composición acuosa que contiene una proteína del plasma soluble en agua, caracterizados por formar vesículas que contienen el compuesto químico inactivante de virus y/o detergente, seleccionando una combinación adecuada de temperatura y concentración, por encima de 0,5 M, de una sal con un alto efecto de salificación de acuerdo con la serie Hofmeister, y retirando posteriormente básicamente todas las vesículas de la fase acuosa, y aislando posteriormente la proteína de la fase acuosa.

Un problema más o menos conocido con las preparaciones farmacéuticas líquidas, es la formación de partículas (aproximadamente 2-75 µm) después de llenar el producto en viales o después de la reconstitución de productos secados por congelación con una solución. Especialmente cuando se trabaja con moléculas más grandes, tales como proteínas, este es un fenómeno que ocurre relativamente a menudo y el mecanismo que hay detrás del mismo no se entiende claramente. Probablemente, es una combinación de factores que se ve afectada por la cantidad y el tamaño en el que se presentan las partículas, incluyendo el tamaño molecular del producto, excipientes del producto, material del recipiente para el producto y solución en la que se reconstituye el producto. Ahora se ha demostrado que podría ser peligroso tener estas cantidades relativamente pequeñas de partículas en los productos. Sin embargo, obviamente, cada productor farmacéutico pretende reducir la cantidad de partículas en los productos tanto como sea posible, especialmente las partículas visibles.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado, sorprendentemente, que una combinación de un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v), tal como sacarosa, y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, puede usarse ventajosamente para precipitar las impurezas, incluyendo virus y proteínas distintas de AT-III, en la purificación de AT-III. Este procedimiento implica diversas ventajas:

• La etapa de precipitación de acuerdo con la invención asegura una alta inactivación viral, alta pureza y desactivación de AT-III mínima.

• La solución de AT-III obtenida puede someterse directamente a pasteurización, sin añadir más compuestos estabilizadores. De esta manera, la combinación de citrato y sacárido sirve para el doble propósito como agentes de precipitación y agentes estabilizadores durante la pasteurización.

• No hay necesidad de retirar la combinación farmacéuticamente aceptable de sacárido y citrato durante la purificación adicional de AT-III. En lugar de ello, los agentes de precipitación también son útiles como estabilizadores de una preparación liofilizada de AT-III.

Por consiguiente, en un primer aspecto, esta invención proporciona un procedimiento para la purificación de antitrombina-III que comprende las etapas de:

(a) añadir una solución que comprende antitrombina-III, un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v) y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, para precipitar las impurezas;

(b) permitir que las impurezas precipiten; y

(c) retirar las impurezas precipitadas obteniendo, de esta manera, una solución que comprende antitrombina-III purificada.

En el presente contexto, el término "impurezas" pretende indicar sustancias no deseadas, incluyendo sustancias usadas durante la purificación de AT-III (cf. Ejemplo 1, más adelante). Las impurezas incluyen, por ejemplo, glicoproteínas ricas en histidina, hemopexina, lipoproteínas, gammaglobulinas, Triton-X-100, tri-n-butil-fosfato, virus, y priones.

La AT-III para su uso en el procedimiento de acuerdo con la invención puede obtenerse por cualquier procedimiento adecuado, y puede ser de mamífero, por ejemplo bovina, porcina o, preferentemente, de origen humano. La AT-III puede obtenerse también por ingeniería genética, tal como por técnicas de ADN recombinante, a partir de animales transgénicos, por ejemplo a partir de leche de oveja, que produce AT-III en su leche.

Independientemente del origen, la AT-III puede ser de cualquier isoforma, por ejemplo α-AT-III o β-AT-lll, o cualquier derivado de AT-III. La diferencia entre α-AT-lll o β-AT-lll se describe, por ejemplo, por Brennan et al. (FEBS Letters 219(2), 431-436, 1987). La expresión "derivado de AT-III" se refiere, por ejemplo a polipéptidos con modificaciones tales como sustituciones, pequeñas deleciones, inserciones o inversiones, polipéptidos que, independientemente de ello, tienen sustancialmente las actividades biológicas de AT-III.

Dicho sacárido es preferentemente un disacárido, tal como sacarosa o trehalosa, o un monosacárido, tal como glucosa, sorbitol, manitol, ácido glucónico, o maltosa. Se prefiere la sacarosa debido a su biodisponibilidad ventajosa en el cuerpo.

Para la precipitación de impurezas, la concentración de sacárido varía de aproximadamente el 10% (p/v) a aproximadamente el 30% (p/v). Preferentemente, la concentración...

1. Un procedimiento de la purificación de antitrombina-III, que comprende las etapas de:

(a) añadir, a una solución que comprende antitrombina-III, un sacárido en una concentración del 10 al 30% (p/v) y citrato en una concentración de 0,1 a 3 M, para precipitar las impurezas;

(b) dejar que las impurezas precipiten; y

(c) retirar las impurezas precipitadas obteniendo, de esta manera, una solución que comprende antitrombina-III purificada.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sacárido se selecciona entre el grupo que consiste en por monosacáridos y disacáridos.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el sacárido es un monosacárido.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la concentración de sacárido es del 15 al 25%.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sacárido es sacarosa.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la concentración de citrato es de 0,5 a 1,5 M.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de citrato es citrato sódico.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, seguido de una etapa de pasteurización de la solución obtenida, que comprende antitrombina-III purificada, en presencia de dicho sacárido y citrato como agentes estabilizadores.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

que comprende adicionalmente una etapa de liofilización.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende adicionalmente una etapa de reconstitución, en la que el medio de reconstitución es un 5 tensioactivo no iónico en una concentración de al menos el 0,01% (p/p).

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medio de reconstitución es un éster de ácido graso de polioxietilen sorbitano.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el medio de reconstitución esta seleccionado entre uno cualquiera de polisorbato 20, polisorbato 21, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85 y polisorbato 120.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el medio de reconstitución es polisorbato 80.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medio de reconstitución es un éster de ácido graso de sorbitano. 20