PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS POR ELECTROPULSACIÓN.

Procedimiento de producción de proteínas por electropulsación. La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteínas de interés. Los microorganismos que son bacterias, hongos, células vegetales, células de insectos y células de animales, y en particular las levaduras, pueden producir proteínas. Sin embargo, es difícil recuperar algunos productos de estos microorganismos y, en particular, recuperar las macromoléculas tales como las proteínas. Para extraer proteínas de interés de levadura, que son proteínas que se producen de forma natural, se sabe que se pueden utilizar, por una parte, métodos mecánicos y, por otra parte, métodos químicos. Cuando se utilizan los métodos mecánicos habituales que constituyen moler y lisar a presión, es imposible no destruir las vacuolas de las levaduras, y la liberación de las proteasas contenidas en las vacuolas plantea problemas de pureza y, por lo tanto, de purificación del producto acabado. Adicionalmente, los métodos químicos conducen igualmente a la destrucción de las vacuolas y utilizan detergentes o agentes de proteólisis que se añaden a los productos químicos utilizados, como contaminantes del medio. Por lo tanto, esto también desemboca en problemas de purificación posteriores. Además, algunos agentes químicos inactivan las enzimas. La presente invención se refiere a una estrategia nueva en la que se aplica un tratamiento de electropulsación sobre una suspensión de células en flujo, seguido de una incubación en un medio adaptado. Las células pueden ser levaduras, pero también bacterias, a las que se les puede aplicar la electropulsación en una suspensión de agua pura, por ejemplo, seguida de una incubación relativamente larga en medio salino, y esto sin que tenga lugar ningún tratamiento previo del cultivo bacteriano con el objetivo de modificarlo mecánica, química o biológicamente. Asimismo, el tratamiento se puede adaptar a las células de mamíferos, lo que se describe a título de información en la presente solicitud y no forma parte de la presente invención. La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de proteínas en el que un flujo de medio líquido que comprende al menos una levadura o una bacteria en suspensión a una concentración comprendida entre 10 6 y 5 x 10 9 células/ml en el medio líquido, se somete a electropulsación, realizándose la electropulsación con intensidades de campo de al menos 1 kV/cm, siendo la duración de los impulsos superior a unos 0,01 ms, durando el tratamiento de electropulsación de 0,01 a 100 s, y la etapa de electropulsación va seguida de una etapa de incubación, y se recuperan las proteínas liberadas. Tal y como aparecerá más adelante, por «electropulsación» se entiende un procedimiento en el que las células se someten a una serie de impulsos eléctricos. Así, la presente invención resuelve los problemas mencionados más arriba. Efectivamente, según la invención, el tratamiento eléctrico no provoca la desintegración de las células y, por lo tanto, no se obtienen fragmentos celulares en el medio después del tratamiento. No se libera todo el contenido de la célula: la pared celular retiene los orgánulos así como la mayor parte de las proteínas grandes citoplasmáticas. Las vacuolas no se ven afectadas y no se liberan las proteasas. La purificación de las proteínas de interés se simplifica y el procedimiento de la invención permite una mayor selectividad de los productos liberados. Se han llevado a cabo trabajos dedicados a la electropulsación en lecho fijo, pero las condiciones descritas en V. Ganeva, B. Galutzov FEMS Microbiology Letters 174 (1999) 279-284 no permiten realizar el presente procedimiento con los resultados esperados. 40 En efecto, el procedimiento en lecho fijo no permite la permeabilización irreversible de todas las células tratadas. Así, la solicitante ha constatado que algunas condiciones de las empleadas en el procedimiento en lecho fijo podían presentar algunos inconvenientes cuando se aplican en flujo.   Se trata especialmente de condiciones relativas a la conductividad del medio de electropulsación. Finalmente, los tratamientos de electropulsación aplicados provocan efectos diferentes sobre las levaduras, según tengan lugar, por una parte, en lecho fijo y, por otra parte, en flujo, y en especial sus efectos sobre el nivel de permeabilización de las células. Además, la inactivación de las enzimas se puede evitar en el procedimiento en flujo, lo que permite evitar el calentamiento excesivo de la suspensión celular. Esto presenta un gran interés, en particular desde el punto de vista de la productividad, al no necesitar una etapa posterior de enfriamiento ni la utilización de los dispositivos necesarios en dicha etapa. Así, según la invención, el tratamiento de una suspensión de las células a una concentración elevada permite obtener 2 una liberación óptima sin provocar el calentamiento del medio. Finalmente, es posible aplicar el procedimiento según la invención sobre volúmenes importantes y obtener grandes cantidades de la proteína de interés con un grado de pureza imposible de obtener hasta ahora mediante otros métodos y, en particular, sin añadir inhibidores de proteasas, con la utilización de medios con una composición simple. 5 En el procedimiento de la invención, la aplicación de un campo eléctrico externo de densidad elevada sobre las células, y en especial sobre las células en suspensión, provoca la aparición de un potencial que se añade al potencial transmembranario. En cuanto se sobrepasa un determinado umbral crítico, la membrana celular se vuelve permeable. Cuando las células están en movimiento (en flujo), su posición cambia con respecto a los electrodos. Los impulsos tendrán por destino diferentes regiones de la superficie. Se acaba obteniendo una superficie permeabilizada más grande 10 y un nivel local de cambio estructural diferente del que se obtiene con las células estáticas (por lotes). Con determinados parámetros del campo eléctrico aplicado, como la intensidad, la duración o el número de impulsos, los cambios de la membrana provocados por los pulsos se pueden volver irreversibles, a lo que sigue una liberación del contenido intracelular. Para las levaduras, que tienen pared, este flujo está controlado por la porosidad de la pared, y la permeabilidad de las diferentes moléculas depende de su tamaño. Los inventores han observado que las membranas de las bacterias se permeabilizan con unos valores del campo eléctrico similares a los valores empleados para las levaduras. La permeabilización es un procedimiento muy rápido que se desarrolla durante algunos milisegundos después de la aplicación de los impulsos eléctricos, y permanece durante un intervalo de tiempo que va de algunos minutos a unas horas después del tratamiento eléctrico. Se ha podido constatar que el tratamiento impuesto a las levaduras puede provocar la liberación de la enzima invertasa, situada en el espacio periplasmático. Parece ser que la pared celular ve aumentada su porosidad por la influencia del campo sobre la membrana plasmática. El procedimiento según la invención permite la salida y también la liberación, y la recuperación posterior de las proteínas secretadas por la célula, que se acumulan en el espacio periplasmático. Según otros aspectos, la invención se refiere igualmente a las proteínas obtenidas por el procedimiento descrito aquí y las composiciones que las comprenden. Desde el punto de vista de las células que se pueden tratar por el procedimiento de la invención, se pueden tratar todas las especies capaces de sintetizar proteínas heterólogas u homólogas, sin que sean limitantes lo los ejemplos que aparecerán más adelante. Para las levaduras, se pueden citar en particular las Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida y Hansenula. Desde el punto de vista de las bacterias, se pueden citar entre otras las bacterias gramnegativas, y en particular E. coli. Desde el punto de vista de las células de mamíferos, se pueden citar entre otros los fibroblastos, y en particular las células de los hámsteres chinos. 35 Según la invención, las células se ponen en cultivo, luego se lavan para eliminar los iones del medio, después se someten al tratamiento eléctrico y se ponen a incubar en medio de incubación. A continuación, estas células se separan del sobrenadante. La purificación de las proteínas se realiza según los medios habituales.   Según la presente invención, a la etapa de electropulsación le precede una etapa de cultivo. Se puede mantener el crecimiento hasta la fase exponencial o hasta la fase estacionaria. Preferentemente, la fase del cultivo es la exponencial, pero se han obtenido resultados positivos también en la fase estacionaria. Por lo tanto, se puede elegir el medio de cultivo para permitir... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento de producción de proteínas en el cual un flujo de medio líquido que comprende al menos una levadura o una bacteria, en suspensión a una concentración comprendida entre 10 6 y 5 x 10 9 células/ml en el medio líquido, se somete a electropulsación, realizándose la electropulsación con intensidades de campo de al menos 1 kV/cm, la duración de los impulsos es superior a unos 0,01 ms y siendo la duración del tratamiento de electropulsación de 0,01 a 100 s, la etapa de electropulsación va seguida de una etapa de incubación, y se recuperan las proteínas liberadas. 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración de levadura(s) o de bacteria(s) en suspensión en el medio líquido está comprendida entre 5 x 10 8 y 5 x 10 9 células/ml. 3.- Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la levadura se escoge entre las especies Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida y Hansenula. 4.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que las proteínas liberadas se separan de las levaduras o de las bacterias mediante filtración o centrifugación. 5.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la intensidad de campo está comprendida entre 1 y 10 kV/cm. 6.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la intensidad de campo está comprendida entre 1 y 5 kV/cm. 7.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la duración de los impulsos es inferior a 100 ms. 8.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la duración de los impulsos está comprendida entre 0,5 y 15 ms. 9.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la duración del tratamiento de electropulsación es de 0,15 a 15 s. 10.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la frecuencia de los impulsos es superior a 0,1 Hz. 11.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la frecuencia de los impulsos es superior a 1 Hz. 12.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la frecuencia de los impulsos está comprendida entre 1 y 500 Hz. 13.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que el número de impulsos recibidos por cada célula de levadura o de bacteria está comprendido entre 1 y 100. 14.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que el número de impulsos recibidos por cada célula está comprendido entre 5 y 20. 15.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que el número de impulsos recibidos por cada célula de levadura o de bacteria es del orden de 10. 16.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por que el medio de incubación comprende al menos una sal. 17.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por que el medio de incubación comprende fosfato de potasio. 18.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado por que el medio de extracción comprende al menos un agente que mantiene la estabilidad de las proteínas extraídas. 19.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado por que el medio de extracción comprende al menos un agente reductor. 20.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado por que el medio de extracción comprende ditiotreitol. 21.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado por que el medio de electropulsación es agua desionizada.   22.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado por que el perfil de los impulsos del campo eléctrico es en ondas cuadradas, trapezoidales, triangulares, sinusoides, sinusoides rectificadas con mono- y bialternancia, o en caída exponencial, unipolares, bipolares, simétricas o asimétricas. 23.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado por que el perfil de los impulsos es en ondas cuadradas. 11