POLIPÉPTIDOS RECONOCIDOS POR ANTICUERPOS ANTI-TRICHINELA Y SUS APLICACIONES.

Utilización de un polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella como reactivo para la detección de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica,

caracterizada por que dicho polipéptido comprende un epítopo inmunodominante del antígeno NBL1, epítopo que está definido por la secuencia PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5)

Polipéptidos reconocidos por anticuerpos anti-Trichinela y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a la utilización de nuevos antígenos identificados en el parásito Trichinella en el marco del diagnóstico y de la prevención de la triquinelosis.

La triquinelosis es una zoonosis asociada al consumo de carne infestada por el parásito Trichinella (MURRELL et al., 2000).

Este nematodo de la clase Adenophorea pertenece a la familia Trichinellidae la cual comprende 8 especies y 3 genotipos emparentados en 2 grupos filogenéticamente distintos: por un lado las triquinas encapsuladas (T. spiralis; T. nativa; T. britovi; T. murrelli; T. nelsoni) que infestan a mamíferos, y por otro lado las triquinas no encapsuladas (T. pseudospiralis; T. papuae; T. zimbabwensis) que infestan a mamíferos, aves y reptiles (GASSER et a1., 2004). Todas estas especies pueden infestar al ser humano.

El ciclo biológico del parásito es auto-heteroxeno: se desarrolla completamente en un mismo huésped que es sucesivamente huésped definitivo (portador de parásitos adultos) y huésped intermedio (portador de larvas infestantes) (BOIREAU et a1., 2002). El paso de las larvas infestantes de un huésped a otro es necesario para la realización de un nuevo ciclo. Este paso se realiza mediante ingestión de carne cruda o poco cocida contaminada por las larvas. Durante la digestión, éstas son liberadas, y penetran en el epitelio intestinal donde mudarán a gusanos adultos (Ad) sexuados. Las hembras fecundadas expulsan a continuación las larvas L1 NeoNatas (L1NN) que alcanzan los músculos estriados a través de la circulación linfática y sanguínea. Estas larvas L1NN penetran en las células musculares (estadio de desarrollo infestante L1M: Larva L1 Muscular) a las que provocan la desdiferenciación en células nutricias rodeadas por una gruesa cápsula de colágeno protectora, en el caso de triquinas encapsuladas, y muy fina en el caso de las triquinas llamadas no encapsuladas.

Mientras que la triquinelosis es asintomática en el animal, la infestación humana se traduce, durante la fase intestinal inicial, en diarreas asociadas a nauseas, vómitos y violentos dolores abdominales, mientras que los síntomas vinculados a la fase de invasión muscular se caracterizan por la asociación de fiebre, edema facial y mialgias (CAPO & DESPOMMIER, 1996). Ataques oculares, pulmonares, gastrointestinales, cardíacos y neurológicos pueden completar este cuadro clínico de la triquinelosis cuya evolución puede ser mortal. El carácter crónico de la infestación, marcado por la persistencia de dolores musculares en los pacientes, está asociado a la supervivencia del parásito dentro de la célula nutricia.

El tratamiento específico de las triquinelosis humanas con antihelmínticos es tanto más eficaz en cuanto el diagnóstico de la infestación se realiza precozmente para permitir una acción contra todos los estadios parasitarios y sobre todo antes de la formación de la cápsula hbox{protectora de colágeno alrededor de las larvas L1M (FOURESTIE et al., 1988).}

Los datos epidemiológicos han demostrado una distribución geográfica del parásito en todas las latitudes asociada a un modo de transmisión que implica muchas especies de la fauna salvaje que mantienen también un ciclo de infestación doméstica representado principalmente por el cerdo (DUPOUY-CAMET, 2000).

Las epidemias de triquinelosis humana, zoonosis emergente o re-emergente, constituyen un auténtico problema de salud pública en el mundo debido a los hábitos alimentarios y a controles sanitarios no siempre eficaces (MURRELL & POZIO, 2000). Estas epidemias implican esencialmente carne de cerdo y de jabalí, así como de caballo (BOIREAU et al., 2000).

La prevención de la contaminación humana pasa, por lo tanto, por una cocción en el centro de la carne y la mejora de las condiciones de cría y/o de control de las triquinelosis animales (cerdo, caballo, jabalí y otras especies animales salvajes sensibles a Trichinella) (BOIREAU et al., 2002).

Las técnicas de cribado de la triquinelosis se dividen en dos categorías: 1) la detección directa de las larvas L1M, mediante triquinoscopia (observación microscópica de un fragmento de carne), o después de la digestión artificial de muestras de músculos, y 2) la detección indirecta mediante diferentes métodos inmunológicos, que permiten detectar anticuerpos dirigidos contra los antígenos de Trichinella.

A cada uno de los estadios de desarrollo del parásito: adulto (Ad), larva neonatal (L1NN), y larva muscular (L1M), le corresponde un perfil antigénico particular.

Son las preparaciones antigénicas obtenidas de larvas del estadio L1M las que se utilizan actualmente para el inmunodiagnóstico. En efecto, las fracciones antigénicas de los dos estadios precoces Ad y L1NN son difíciles de purificar, y hasta ahora no se habían podido identificar antígenos inmunodominantes asociados a uno y/o a otro de estos dos estadios.

Se utilizan principalmente preparaciones de antígeno total soluble, obtenidas mediante lisis de las larvas, centrifugado del lisado, y recuperación del sobrenadante o, más frecuentemente, antígenos de excreción/secreción (antígenos E/S).

Los antígenos de excreción-secreción son producidos durante la puesta de las larvas L1M en condiciones de supervivencia en un medio de cultivo; éstos proceden de un órgano particular, denominado el esticosoma, que está constituido por una cincuentena de células discoidales, los esticocitos. Los esticocitos contienen gránulos cuyo contenido es evacuado por un canalículo en la luz del esófago del parásito. Este contenido es muy antigénico, constituye una parte de los antígenos de excreción secreción. Estos antígenos forman una mezcla compleja de proteínas, que contiene particularmente un grupo de glucoproteínas (denominadas antígenos TSL1) que portan una molécula glucídica particular, conocida únicamente en Trichinella y presente en todas las especies de este parásito, la beta-tivelosa.

Las preparaciones de antígenos de excreción-secreción que se utilizan actualmente como referencia en materia de inmunodiagnóstico de la triquinelosis se obtienen a partir de medio de cultivo de larvas L1M de Trichinella spiralis. Después de 18 a 20 horas de cultivo, el medio se recupera por filtración, y a continuación se concentra (GAMBLE et al., 1983; GAMBLE et al., 1988).

Las preparaciones de antígeno total soluble tienen, como principal inconveniente, su falta de especificidad. Frecuentemente se observan reacciones antigénicas cruzadas con otras parasitosis. Los antígenos de excreción-secreción permiten obtener una mejor especificidad. Sin embargo, en los dos casos, resulta difícil producir en gran cantidad lotes estandarizados de antígeno.

Las secuencias de ADN que codifican el antígeno E/S, y sus utilizaciones para producir antígenos útiles para el diagnóstico o la vacunación contra la infección por T. spiralis, se divulgan en la patente US5422263.

Los antígenos de Trichinella y sus epítopos inmunodominantes son revisados por Boireau et al., MULTIDISCIPLINARITY FOR PARASITES, VECTORS AND PARASITIC DISEASES, VOL 1 MEDIMOND PUBLISHING CO, VIA RUBBIANI 6/2, 40124 BOLONIA, ITALIA, páginas 181-188; 2004.

La estructura sacarídica que contiene beta-tivelosa, que representa un epítopo inmunodominante de las preparaciones de antígeno E/S (REASON et al., 1994; Patentes US 5541075 y 5707817) se sintetizó químicamente, y se ha propuesto su utilización para el inmunodiagnóstico de Trichinella.

Este reactivo presenta una buena especificidad, pero su sensibilidad parece más reducida que la de las preparaciones de antígeno E/S. Además, la síntesis de esta estructura por vía química sigue siendo costosa y pesada de realizar.

Otro problema que se plantea en el marco del diagnóstico serológico de Trichinella es la existencia de una "ventana ciega" de detección que corresponde a los estadios precoces de la infestación, lo que se traduce en resultados falsos negativos. Además, en el caballo, se ha observado una desaparición progresiva de los anticuerpos 25 semanas después de la infestación.

Los inventores intentaron identificar antígenos inmunodominantes... [Seguir leyendo]

1. Utilización de un polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella como reactivo para la detección de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizada por que dicho polipéptido comprende un epítopo inmunodominante del antígeno NBL1, epítopo que está definido por la secuencia PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5).

2. Utilización de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizada por que se utiliza una mezcla que comprende uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos que comprenden los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4, o que comprenden una secuencia que presenta al menos el 70% de identidad con la secuencia de los aminoácidos 25-175 de la secuencia SEC ID Nº 4.

3. Polipéptido antigénico reconocido por anticuerpos anti-Trichinella, tal como se define en la Reivindicación 1, con la exclusión del polipéptido identificado por el número de entrada del GenBank AAK16520.1 y del polipéptido identificado por el número de entrada del GenBank AAR36900.1.

4. Polipéptido antigénico de acuerdo con la Reivindicación 3, que contiene una o más de las siguientes secuencias: la secuencia: PSSGSRPTYPSSGSR (SEC ID Nº 6); la secuencia PSSGSRPTYPYTGSR (SEC ID Nº 7); y la secuencia RPTSPSSGSRPTYPS (SEC ID Nº 8).

5. Polipéptido antigénico de acuerdo con la Reivindicación 4, que contiene los aminoácidos 363-409 de la secuencia SEC ID Nº 2.

6. Polipéptido antigénico de acuerdo con la Reivindicación 3, caracterizado por que está constituido por un polipéptido quimérico que comprende una o más copias de un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 1, opcionalmente con una o más copias de un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 2, eventualmente fusionados con una o varias secuencias heterólogas.

7. Polinucleótido que codifica un polipéptido antigénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 3 a 6.

8. Vector recombinante que contiene uno o más polinucleótidos de acuerdo con la Reivindicación 7.

9. Célula huésped transformada por un vector recombinante de acuerdo con la Reivindicación 8.

10. Utilización de un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 1, para la obtención de una composición utilizable para la producción de anticuerpos.

11. Anticuerpo que reconoce específicamente a un polipéptido tal como se define en la Reivindicación 1.

12. Anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado por que reconoce al epítopo PSSGSRPTYP (SEC ID Nº 5).

13. Procedimiento de detección de la presencia de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, procedimiento que se caracteriza por que comprende:

- la puesta en contacto de dicha muestra biológica con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2, en condiciones que permiten la formación de un complejo antígeno/anticuerpo con los anticuerpos anti-Trichinella eventualmente presentes en dicha muestra;

- la detección, mediante cualquier medio apropiado, del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado.

14. Kit para la detección de la presencia de anticuerpos anti-Trichinella en una muestra biológica, caracterizado por que comprende uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2 y, llegado el caso, tampones y reactivos apropiados para la constitución de un medio de reacción que permita la formación de un complejo antígeno/anticuerpo y, opcionalmente, medios de detección de dicho complejo antígeno/anticuerpo.

15. Kit de acuerdo con la Reivindicación 14, caracterizado por que dicho(s) polipéptido(s) está(n) inmovi- lizado(s) sobre un soporte sólido.

16. Composición inmunógena, que comprende uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2, o uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 1, opcionalmente en combinación con uno o más polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos tal como se definen en la Reivindicación 2, asociados a uno o más adyuvantes que permiten mejorar la respuesta inmunitaria.

17. Composición inmunógena de acuerdo con la Reivindicación 16, caracterizada por que se trata de una vacuna.