Un procedimiento in vitro para transportar un compuesto biológicamente activo al citoplasma de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con dicho compuesto biológicamente activo y un polianión con actividad sobre la membrana que comprende un copolímero alterno basado en éter vinílico - anhidrido maleico,

dicho polianión es capaz de endosomolisis que se determina usando un ensayo de hemólisis, tal que el polianión con actividad sobre la membrana y el compuesto biológicamente activo sufren endocitosis por la célula

REFERENCIA CRUZADA PARA SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud está relacionada con la solicitud anterior provisional de documento de patente de Estados Unidos Nº de serie 60-443906 presentada el 31 de enero de 2003.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La vía de penetración celular para la mayor parte de los fármacos convencionales es la difusión a través de las membranas biológicas. Por esta razón, los fármacos tienden a ser moléculas pequeñas (Pm < 500) y anfipáticas, que contienen tanto funcionalidades hidrófobas como hidrófilas. Estas características engendran moléculas con solubilidad acuosa, al tiempo que les permiten cruzar la bicapa lipídica no polar de la membrana celular. Por el contrario, los fármacos utilizados en las terapias antisentido y génicas son polímeros hidrófilos relativamente grandes y con frecuencia también ácidos nucleicos cargados muy negativamente. Ambas de estas características físicas obstaculizan su difusión directa a través de la membrana celular. Por esta razón, la principal barrera para la terapia génica y terapia antisentido es el transporte del fármaco al interior celular. Esta situación contrasta con el desarrollo de medicamentos estándar en el que la identificación del fármaco es la principal barrera en el desarrollo.

La ruta de entrada para la mayoría de las macromoléculas como el ADN y oligonucleótidos en células es la endocitosis. Una vez absorbidas por la célula, el endosoma es o bien reciclado de vuelta a la superficie celular, o madura a un endosoma final y finalmente a un lisosoma. En este proceso, el pH gradualmente disminuye de 7 a 6 a medida que el endosoma inicial se convierte en endosoma final. En el endosoma final, el pH disminuye de 6 a menos de 5 a medida que madura en un lisosoma. En el endosoma final y lisosoma, enzimas tales como proteasas, nucleasas y glicosilasas digieren los componentes hidrolizables en el compartimento. Para evitar la degradación de los ácidos nucleicos y otros fármacos potenciales en el lisosoma, debe romperse el endosoma, y su contenido liberado, antes de su evolución a un lisosoma. Una vez que se produce la endocitosis, el endosoma se convierte en un endosoma final en el curso de unos 10 minutos [Mukherjee et al. 1997]. El endosoma final contiene enzimas hidrolíticas tales como proteasas [Berg et al. 1995] y otras enzimas hidrolíticas. Enzimas digestivas adicionales aparecen a medida que el endosoma se transforma en un lisosoma.

Para que los materiales escapen de los endosomas al citoplasma, la membrana del endosoma debe romperse. La ruptura del endosoma puede ocurrir por presión osmótica que causa que la membrana se hinche y explote [Zuber et al. 2001], por agentes perturbadores de la membrana que desnaturalizan la estructura de dos capas de la membrana, o una combinación de estas fuerzas. Métodos para lograr la liberación del endosoma a menudo se basan en el entorno del lisosoma y/o endosoma para desencadenar la ruptura de la membrana y liberar su contenido. Por ejemplo, los vectores pueden ser sustratos de enzimas lisosomales tales como las proteasas. La proteolisis puede dar como resultado una activación de un compuesto activo sobre la membrana que a continuación desestabiliza las dos capas. Un ejemplo de rotura de membrana desencadenada por enzimas son las proteínas de la cubierta de los adenovirus que modifican su estructura y su capacidad disruptiva de la membrana con la ruptura proteolítica [Skehel et al. 2000].

La disminución en el pH a medida que un endosoma madura a un lisosoma puede también utilizarse para desencadenar la disrupción de la membrana y la liberación de su contenido. Las infecciones virales a menudo requieren la acidificación del compartimento endosomal [Carrasco 1994]. Para imitar esta actividad viral sintéticamente, se han diseñado muchos agentes de transfección no víricos con componentes dependientes de pH. Agentes que son débilmente básicos, pKa 5-7, pueden ser protonados de forma reversible en el entorno ácido del endosoma. Algunos ejemplos son la cloroquina, polietilenimina y poli-L-lisina histidilada. El efecto de estos compuestos tampón es aumentar el número de protones necesarios para una disminución en el pH. Se postula que el aumento del número de protones, y como consecuencia sus contraiones, produce un aumento en la presión osmótica del endosoma, que lleva a la ruptura de la membrana, el efecto de esponja de protones [Zuber et al. 2001].

Otro mecanismo para la disrupción de la membrana dependiente del pH es el uso de agentes cuya interacción con una membrana depende de su protonación, por ejemplo, el hemisuccinato de colesterol [Lai et al. 1985], péptidos de la cubierta vírica y sus derivados [Plank et al. 1998] y ácido polipropilacrílico (PPA) [Cheung et al. 2001]. Una característica común de estos agentes es que son moléculas que contienen ácidos carboxílicos y grupos hidrófobos que están menos cargados a medida que baja el pH. La disminución en la carga hace que las moléculas sean más hidrófobas, y por lo tanto más disruptivas de las membranas.

El polímero sintético más estudiado que contiene carboxilatos para la disrupción del endosoma es el PPA [Lackey et al. 2002]. El grupo de propilo en cada monómero de grupos de PPA constituyen los grupos hidrófobos del polímero. Otro polímero sintético que contiene carboxilatos es el ácido polietilacrílico (PEA). PEA también es activo en la membrana de manera dependiente del pH. Sin embargo, dependiendo del peso molecular del polímero, se produce el inicio de la actividad de membrana para PEA muy por debajo del pH de 6. Mediante el aumento de la longitud del grupo hidrófobo de PEA por un carbono, para producir PPA, la dependencia del pH del polímero cambia a condiciones menos ácidas tal que la iniciación de la actividad de la membrana se produce al pH fisiológicamente más pertinente de 6,5. Además de los ácidos poliacrílicos, polímeros de ácidos poliaminos que contengan residuos de aspartato o glutamato también exhiben carga negativa sensible al pH. Muchos polímeros naturales sensibles al pH dependen de estos residuos aniónicos para su dependencia del pH

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En una realización preferida, describimos una clase de polímeros aniónicos basados en el anhidrido maleico capaces de romper las membranas celulares. Los polímeros pueden ser homopolímeros, copolímeros aleatorios o copolímeros alternos. Se incorporan grupos hidrófóbos en los polímeros por medio de la copolimerización con monómeros hidrófobos o haciendo reaccionar grupos hidrófobos con anhidridos en el polímero.

En una realización preferida los polímeros descritos pueden utilizarse para transportar compuestos biológicamente activos a las células in vivo o in vitro. Los polímeros facilitan la liberación de compuestos biológicamente activos desde vesículas en el citoplasma después de la coendocitosis del polímero y el compuesto. En una realización, el compuesto biológicamente activo y el polímero se asocian con la célula de manera que en ambas moléculas se produce endocitosis por la célula. En otra realización el compuesto biológicamente activo y el polímero se asocian entre sí a través de una interacción no covalente para formar un complejo. El complejo es, a continuación, asociado a la célula. En otra realización, el compuesto biológicamente activo se une de forma covalente al polímero. La molécula de polímero-compuesto es, a continuación, asociada a la célula.

En una realización preferida, la funcionalidad del polímero puede ser modificada o mejorada por la unión covalente de grupos funcionales. Pueden agregarse grupos funcionales al polímero por medio de la copolimerización o por medio de la reacción con un anhidrido en el polímero.

Más objetos, características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada cuando se tome junto con los dibujos que la acompañan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1 Ilustración de la formación de polianiones basada en la polimerización de anhidrido maleico: homopolímeros, copolímeros aleatorios, y copolímeros alternos. Los grupos carboxilo se muestran en forma protonada.

FIG. 2 Ilustración de polímeros sintetizados por polimerización del polímero de butil vinil éter -anhidrido maleico (BVEMA) con alcoholes y aminas para formar ésteres y amidas. Los grupos carboxilo se muestran en forma protonada.

FIG. 3. Ilustración gráfica del potencial hemolítico de los polímeros BVEMA,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para transportar un compuesto biológicamente activo al citoplasma de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con dicho compuesto biológicamente activo y un polianión con actividad sobre la membrana que comprende un copolímero alterno basado en éter vinílico – anhidrido maleico, dicho polianión es capaz de endosomolisis que se determina usando un ensayo de hemólisis, tal que el polianión con actividad sobre la membrana y el compuesto biológicamente activo sufren endocitosis por la célula.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma no covalente al polianión con actividad sobre la membrana.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma covalente al polianión con actividad sobre la membrana.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el éter vinílico se selecciona del grupo que comprende alquil vinil éter y aril vinil éter.

5. El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el alquil vinil éter se selecciona del grupo que consiste en: propil vinil éter y butil vinil éter.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde un grupo hidrófobo se une de forma covalente al monómero anhídrido en el polianión con actividad sobre la membrana.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en donde los grupos hidrófobos se seleccionan del grupo que consiste en: ésteres hidrófobos y amidas hidrófobas.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde un grupo funcional se une de forma covalente a un monómero anhídrido en el polianión con actividad sobre la membrana.

9. Un compuesto biológicamente activo y un polianión con actividad sobre la membrana, en donde el polianión es capaz de endosomolisis que se determina usando un ensayo de hemólisis, que comprende un copolímero alterno basado en éter vinílico – anhidrido maleico para uso en la terapia génica, en donde la terapia génica comprende el transporte del compuesto biológicamente activo al citoplasma de una célula poniendo en contacto dicha célula con el compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad en la membrana, de manera que el polianión y el compuesto biológicamente activo sufren endocitosis por la célula.

10. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma no covalente al polianión con actividad sobre la membrana.

11. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde el compuesto biológicamente activo está asociado de forma covalente al polianión con actividad sobre la membrana.

12. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde el éter vinílico se selecciona del grupo que comprende alquil vinil éter y aril vinil éter.

13. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 12, en donde el alquil vinil éter se selecciona del grupo que consiste en: propil vinil éter y butil vinil éter.

14. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde un grupo hidrófobo se une de forma covalente a un monómero anhidrido en el polianión con actividad sobre la membrana.

15. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 14, en donde los grupos hidrófobos se seleccionan del grupo que consiste en: ésteres hidrófobos y amidas hidrófobas.

16. El compuesto biológicamente activo y el polianión con actividad sobre la membrana de la reivindicación 9, en donde un grupo funcional está unido de forma covalente a un monómero anhidrido en el polianión con actividad sobre la membrana.