PÉPTIDOS DE LACTOFERRINA ÚTILES COMO PÉPTIDOS DE PENETRACIÓN CELULAR.

Un complejo que comprende un péptido y una molécula cargadora,

donde el péptido se deriva de la lactoferrina y es adecuado para actuar como péptido de penetración celular, que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC. ID Nº: 03, SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 29, SEC. ID Nº: 30, SEC. ID Nº: 7, SEC. ID Nº: 8, SEC. ID Nº: 9, SEC. ID Nº: 10, SEC. ID Nº: 28, SEC. ID Nº: 11, SEC. ID Nº: 12 o SEC. ID Nº: 13, SEC. ID Nº: 14 o SEC. ID Nº: 15 o derivados que tienen un grupo de unión seleccionado del grupo de los tioésteres, donde el grupo de unión reemplaza el enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína

La presente invención se refiere a un péptido que es adecuado para usar como un péptido de penetración celular, a los complejos que lo comprenden y al uso de estos.

Los péptidos de penetración celular (CPP) como la penetratina derivada de antennapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem., 269, 10444-10450, 1994) y el péptido Tat (Vives et al., J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, 1997) son herramientas ampliamente utilizadas para la administración de moléculas cargadoras como péptidos, proteínas y oligonucleótidos (Fischer et al., Bioconjug. Chem., 12, 825-841, 2001) a las células. Las áreas de aplicación varían desde la investigación puramente biológica celular a la investigación biomédica (Dietz y Bähr, Mol. Cell., Neurosci, 27, 85 -131, 2004). Inicialmente, se creía que la absorción celular ocurría por penetración directa de la membrana plasmática (Prochiantz, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 400-406, 2000). En los últimos años, se acumularon pruebas de que para varios CPP la endocitosis contribuye al menos significativamente a la absorción celular para varios CPP (por una revisión, consulte Fotin-Mleczek et al., Curr. Pharm. Design, 11, 3613-3628, 2005). Dados estos resultados recientes, la especificación de un péptido como un CPP no implica por lo tanto un mecanismo de importación celular específico, sino que se refiere más bien a una función como péptido que, cuando se conjuga con una molécula cargadora, ya sea covalentemente o no covalentemente, mejora la absorción celular de la molécula cargadoras.

WO 00/04132 A describe la producción de masa del polipéptido lactoferrina a partir de levadura y microorganismos útiles.

Moriarty et al., FEMS Microbiol.Letters (2004) 239, 2, 295-299, XP004597837, se relaciona con factores que contribuyen a la potencia de péptidos catiónicos de la región N-terminal de la lactoferrina humana.

Aguilera et al., FEBS Letters (1999) 462, 3, 273-277, XP004260630 describe la acción de permeabilización de un péptido derivado de lactoferricina en las membranas bacterianas y artificiales.

WO 00/01730 A describe péptidos basados en la secuencia de la lactoferrina humana y sus usos.

Vogel et al., Biochimie et Biologie Cellulaire, XX, XX, 80, 1, 49-63, XP008059255, describe un análisis dirigido a estructura-función de la lactoferricina bovina y péptidos relacionados que contienen arginina y triptofano.

Shibli et al. (2002), Biochem. Cell. Biol, 80, p. 667 - 677) describe péptidos antimicrobianos ricos en triptofano, propiedades comparativas e interacciones de membrana.

He y Furmanski (1995), Nature, 373, p. 721 - 724) describe la unión de la lactoferrina al ADN.

Derossi et al. (1998), Trends Cell. Biol., 8, p. 84 - 87) tratan "Péptidos troyanos: el sistema de la penetratina para la administración intracelular".

Aunque esos CPP han demostrado ser en principio adecuados para la administración de péptidos, proteínas y oligonucleótidos a las células, todavía es necesario proporcionar otros CPP que permitan la administración de dichas moléculas como moléculas cargadoras. En particular, existe la necesidad de CPP que (i) permitan una rápida liberación de la molécula cargadora desde la vía endolisosómica y (ii) eviten reacciones inmunológicas en el momento de la aplicación a un ser humano.

El problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante las características de las reivindicaciones de la presente.

En una realización del primer aspecto el péptido comprende al menos cuatro aminoácidos catiónicos.

En una realización del primer aspecto el péptido comprende al menos dos residuos Cys o análogos de esta.

En una realización preferida del primer aspecto el péptido comprende un enlace disulfuro creado por dos residuos Cys o un enlace análogo formado por análogos de la cisteína.

En una realización del primer aspecto el péptido comprende una porción que tiene conformación de hélice alfa de aproximadamente 12 a 20 aminoácidos de longitud, y una porción que tiene una conformación de hoja beta de aproximadamente 8 a 12 aminoácidos de longitud.

En una realización del primer aspecto el péptido tiene una secuencia de aminoácidos, donde el extremo N-terminal del péptido es un aminoácido que corresponde a los aminoácidos de las posiciones 20 a 64 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC. ID Nº: 1 o SEC. ID Nº: 2.

En una realización del primer aspecto el péptido se selecciona del grupo que comprende

un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR (SEC. ID Nº: 3), un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos CFQWQRNMRKVRGPPVSC (SEC. ID Nº: 4), un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos KCRRWQWRMKKLGAPSITCVRR (SEC. ID Nº: 29), y un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos CRRWQWRMKKLGAPSITC (SEC. ID Nº: 30) y sus derivados.

En una realización preferida de la presente invención los péptidos de penetración celular comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC. ID Nº: 3, SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 29 o SEC. ID Nº: 30.

Los péptidos preferidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC. ID Nº: 3, SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 29 o SEC. ID Nº: 30 poseen una carga catiónica, en particular de al menos cuatro aminoácidos catiónicos ubicados en SEC. ID Nº: 3, SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 29 o SEC. ID Nº: 30. Otra característica preferida de dichos péptidos es la presencia de al menos dos cisteínas o análogos de la cisteína que pueden formar un puente disulfuro o un puente análogo. Ambas cisteínas o sus análogos encierran menos de 6 aminoácidos.

En una realización preferida del primer aspecto el péptido es un derivado de los péptidos de acuerdo con SEC. ID Nº: 3 o 4, donde el residuo de metionina es reemplazado por un aminoácido seleccionado del grupo que comprende valina, isoleucina, norvalina, leucina y norleucina.

En una realización más preferida del primer aspecto el péptido es un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende

KCFQWQRNVRKVRGPPVSCIKR (SEC. ID Nº: 7) KCFQWQRNIRKVRGPPVSCIKR (SEC. ID Nº: 8) KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEC. ID Nº: 9), donde X es norvalina, KCFQWQRNLRKVRGPPVSCIKR (SEC. ID Nº: 10), KCFQWQRNXRKVRGPPVSCIKR (SEC. ID Nº: 28), donde X es norleucina, CFQWQRNVRKVRGPPVSC (SEC. ID Nº: 11), CFQWQRNIRKVRGPPVSC (SEC. ID Nº: 12), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEC. ID Nº: 13), donde X es norvalina, CFQWQRNLRKVRGPPVSC (SEC. ID Nº: 14), CFQWQRNXRKVRGPPVSC (SEC. ID Nº: 15), donde X es norleucina,

En una realización del primer aspecto los derivados tienen un grupo de unión seleccionado preferentemente del grupo que comprende tioéteres, donde el grupo de unión reemplaza al enlace disulfuro formado por esos residuos de Cys. [0025] En una realización del primer aspecto, el péptido está marcado radiactivamente, preferentemente por haber incorporado un aminoácido marcado radiactivamente, donde más preferentemente el aminoácido marcado radiactivamente es un aminoácido marcado con tritio.

En una realización del primer aspecto el péptido comprende además una porción que es adecuada para detección usando un método para detección, donde dicha porción se selecciona preferentemente del grupo que comprende fluoróforos, trazadores radiactivos y haptenos, donde preferentemente el hapteno es biotina.

El problema subyacente a la presente invención también se resuelve en un segundo aspecto mediante un complejo que comprende un péptido seleccionado del grupo que comprende un péptido de acuerdo con el primer aspecto y una molécula cargadora.

En una realización del segundo aspecto la molécula cargadora está unida al péptido covalentemente o no covalentemente.

En una realización del segundo aspecto la molécula cargadora se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos y moléculas pequeñas, y mezclas de cualquiera de ellos.

En una realización del segundo aspecto la molécula cargadora está presente como una estructura o parte de una estructura, donde la estructura se selecciona del grupo que comprende nanopartículas, micropartículas, liposomas y micelas.

En una realización preferida del segundo aspecto el ácido nucleico es un ácido nucleico... [Seguir leyendo]

1. Un complejo que comprende un péptido y una molécula cargadora, donde el péptido se deriva de la lactoferrina y es adecuado para actuar como péptido de penetración celular, que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEC. ID Nº: 03, SEC. ID Nº: 4, SEC. ID Nº: 29, SEC. ID Nº: 30, SEC. ID Nº: 7, SEC. ID Nº: 8, SEC. ID Nº: 9, SEC. ID Nº: 10, SEC. ID Nº: 28, SEC. ID Nº: 11, SEC. ID Nº: 12 o SEC. ID Nº: 13, SEC. ID Nº: 14 o SEC. ID Nº: 15 o derivados que tienen un grupo de unión seleccionado del grupo de los tioésteres, donde el grupo de unión reemplaza el enlace disulfuro formado por los residuos de cisteína.

2. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1, donde la molécula cargadora está unida al péptido covalentemente o no covalentemente.

3. El complejo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la molécula cargadora se selecciona del grupo que comprende ácidos nucleicos, aminoácidos, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos y moléculas pequeñas, y mezclas de cualquiera de ellos.

4. El complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la molécula cargadora está presente como una estructura o parte de una estructura, donde la estructura se selecciona del grupo que comprende nanopartículas, micropartículas, liposomas y micelas.

5. El complejo de acuerdo con la reivindicación 3, donde el ácido nucleico es un ácido nucleico seleccionado del grupo que comprende moléculas de ADN, moléculas de ARN, moléculas de ANP, moléculas de ARNip, moléculas antisentido, ribozimas, aptómeros, spiegelmers y moléculas señuelo.

6. El complejo de acuerdo con la reivindicación 3, donde la molécula cargadora es un péptido seleccionado del grupo que comprende péptidos aptos para vacunación.

7. El complejo de acuerdo con la reivindicación 3, donde el ácido nucleico es una vacuna a base de ácido nucleico.

8. Complejo de acuerdo con la reivindicación 3, donde las nanopartículas y/o las microparticulas comprenden o consisten en un compuesto farmacéuticamente activo.

9. Una composición que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y una molécula cargadora.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde la molécula cargadora es un ARN adecuado para vacunación.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde la molécula cargadora es un ácido nucleico que codifica un péptido.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, donde el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 está unido operativamente a la molécula cargadora que es un ácido nucleico que codifica un péptido.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, donde el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 y la molécula cargadora que es un ácido nucleico que codifica un péptido están unidos en el marco.

14. La composición de acuerdo con las reivindicaciones 11 - 13, donde el péptido es un principio farmacéuticamente activo.

15. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde el ácido nucleico tiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEC. ID Nº: 26.

16. Un péptido como el definido de la reivindicación 1 para usar como un péptido de penetración celular (CPP).

17. Un péptido de acuerdo con la reivindicación 16, donde el péptido de penetración celular (CPP) es adecuado para penetrar la membrana plasmática de las células mamíferas.

18. Un péptido como el definido de la reivindicación 1 para usar como un agente de transfección.

19. El uso de una composición de acuerdo con las reivindicaciones 9 - 15 para la fabricación de un medicamento.

5 20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde la molécula cargadora es un principio farmacéuticamente activo.

21. El uso de una composición de acuerdo con las reivindicaciones 9 - 15 para la fabricación de un agente de diagnóstico.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, donde la molécula cargadora es un marcador para diagnóstico.