OLIGONUCLEÓTIDOS INHIBIDORES Y SU UTILIZACIÓN PARA REPRIMIR ESPECÍFICAMENTE UN GEN QUIE CODIFICA PARA UN RECEPTOR DE LOS ANDRÓGENOS.
Oligonucleótido bicatenario, caracterizado porque está constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprenden cada una en uno de sus extremos 3' o 5' de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido,
siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2002/003843.
Solicitante: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS).
Nacionalidad solicitante: Francia.
Dirección: 3, RUE MICHEL-ANGE 75794 PARIS CEDEX 16 FRANCIA.
Inventor/es: CHAUCHEREAU,ANNE, CABON-GEORGET,FLORENCE, DAUTRY,FRANCOIS, AIT-SI-ALI,SLIMANE, HAREL-BELLAN,ANNICK, MARTINEZ,LUIS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 8 de Noviembre de 2002.
Fecha Concesión Europea: 18 de Agosto de 2010.
Clasificación PCT:
- A61K31/713 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Acidos nucleicos u oligonucleótidos con estructura en doble hélice.
- C12N15/113 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido.
Clasificación antigua:
- A61K31/713 A61K 31/00 […] › Acidos nucleicos u oligonucleótidos con estructura en doble hélice.
- C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
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Fragmento de la descripción:
La presente invención se refiere al campo de la investigación y del tratamiento genéticos de patologías humanas, en particular de los cánceres o de las enfermedades infecciosas. Más particularmente, la invención prevé proporcionar unos medios para determinar la función de un gen o de una familia de genes implicados en un proceso celular, y para reprimir un gen nocivo responsable de una patología en el ser humano o en el animal. La invención se refiere a los agentes activos para la realización de estos métodos y a las composiciones que los contienen.
Se conoce en la técnica anterior, unas técnicas de oligonucleótidos anti-sentido que permiten inhibir específicamente un gen en las células de mamíferos. Estas técnicas se basan en la introducción en las células de un oligonucleótido corto de ADN complementario del gen diana. Este oligonucleótido induce la degradación del ARN mensajero transcrito por el gen diana. Otro modo de acción de los anti-sentido consiste en introducir en la célula un oligonucleótido de ADN que formará una triple hélice con el gen diana. La formación de esta triple hélice reprime el gen, o bien bloqueando el acceso para unas proteínas activadoras, o bien en unos enfoques más sofisticados, induciendo la degradación del gen. Ninguno de estos enfoques parece apoyarse en un mecanismo celular existente en las células de mamíferos, y han demostrado ser poco eficaces. En efecto, la utilización de los anti-sentido en clínica se reduce a algunos casos raros, y no existe ninguna utilización posible de los oligonucleótidos que forman una triple hélice.
El método de la invención se basa en la interferencia ARN designada también "ARN'inh" o "ARNi" o también co-supresión, que se ha demostrado en las plantas. En las plantas, se ha observado que la introducción de un ARN largo bicatenario, que corresponde a un gen, induce la represión específica y eficaz del gen diana. El mecanismo de esta interferencia comprende la degradación del ARN bicatenario en dúplex cortos de oligonucleótidos de 20 a 22 nucleótidos.
Los inventores han demostrado ahora que este principio se puede aplicar a unos genes de mamíferos que desempeñan un papel importante en el control del destino celular.
El enfoque "ARN'inh" denominado más generalmente según la invención oligonucleótidos inhibidores o ARNi se basa en un mecanismo celular cuya importancia se subraya por su gran grado de conservación puesto que este mecanismo está conservado a través de los reinos y las especies, y ha sido demostrado no sólo en la planta, sino también en el gusano Caenorhabditis Elegans y la levadura y los mamíferos, seres humanos y ratones.
Los estudios de investigación realizados en el marco de la invención han mostrado que este enfoque es mucho más eficaz para reprimir específicamente los genes que las técnicas previstas en la técnica anterior. Además, reúne potencialmente las ventajas de los anti-sentido y de los anti-genes. En efecto, en la planta, la co-supresión se efectúa a nivel post-transcripcional, en el ARN maduro, pero también a nivel transcripcional, por lo tanto, en el gen en sí. En efecto, la represión se transmite de generación en generación y
permitiría por lo tanto reprimir un gen de manera prolongada, incluso definitiva.
La invención tiene por lo tanto por objeto un oligonucleótido bicatenario constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprende cada una en uno de sus extremos 3' o 5' de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16.
Cada una de las dos secuencias oligonucleotídicas complementarias comprende en uno de los extremos 3' o 5' de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido.
Ventajosamente, las dos secuencias oligonucleotídicas tienen el mismo tamaño.
Debido a la ley de apareamiento de las bases, se designará asimismo de forma indistinta a continuación por oligonucleótido de la invención, una u otra de las secuencias del oligonucleótido bicatenario de la invención que es complementario de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SECIDnº 16.
Los oligonucleótidos pueden ser de naturaleza ribonucleotídica, desoxirribonucleotídica o mixta. Se describe asimismo el oligonucleótido complementario de la secuencia diana, designado asimismo hebra antisentido, mayoritariamente de naturaleza ribonucleotídica. La hebra sentido puede ser de naturaleza ribonucleotídica, desoxirribonucleotídica o mixta. Unos ejemplos de oligonucleótidos de tipo ARN/ARN o ADN/ARN se proporcionan en la parte experimental a continuación.
En efecto, los híbridos ARN/ARN son más estables que los híbridos ADN/ADN o ADN/ARN y mucho más estables que los ácidos nucleicos monocatenarios utilizados en unas estrategias anti-sentido.
Se entiende asimismo por oligonucleótido, un polinucleótido de 2 a 100, y más generalmente de 5 a 50, nucleótidos de tipo ribo-, desoxirribo-o mixto.
Se describe la parte de la secuencia oligonucleotídica que se hibrida y complementaria de la secuencia diana que tiene un tamaño comprendido entre 15 y 25 nucleótidos, y muy preferentemente de 20 a 30 nucleótidos.
Los oligonucleótidos bicatenarios de la invención comprenden en uno de sus extremos 3' a 5' de cada hebra, de 1 a 5 nucleótidos, preferentemente de 2 a 3, y muy preferentemente 2 nucleótidos desbordantes del híbrido. Estos nucleótidos desbordantes del híbrido pueden ser o no complementarios de la secuencia diana. De esta manera, según la invención, los nucleótidos desbordantes del híbrido son unos nucleótidos
cualquiera, por ejemplo unas timinas.
Se puede representar un oligonucleótido bicatenario de la invención de la siguiente manera, en la que cada guión corresponde a un nucleótido y en la que cada hebra comprende en su extremo 3' dos timinas desbordantes del híbrido.
**(Ver fórmula)**
La secuencia de los oligonucleótidos descritos es sustancialmente complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN mensajero de un gen que se desea reprimir específicamente. A pesar de que se prefieren unos oligonucleótidos perfectamente complementarios de la secuencia diana, se entiende por sustancialmente complementaria, el hecho de que la secuencia oligonucleotídica puede comprender algunos nucleótidos mutados con respecto a la secuencia diana a partir de que las propiedades de represión del gen en cuestión no son alteradas. De esta manera, una secuencia oligonucleotídica descrita puede comprender de 1 a 3 nucleótidos mutados.
Estos nucleótidos mutados descritos pueden ser por lo tanto los desbordantes del híbrido o unos nucleótidos en el interior de la secuencia oligonucleotídica.
Un oligonucleótido de la invención es un híbrido perfecto. La parte de la secuencia oligonucleotídica que se hibrida es perfectamente complementaria de la secuencia diana mientras que los nucleótidos desbordantes del híbrido pueden ser cualquiera y en particular unas timinas. Se entiende de esta forma asimismo por perfectamente complementaria el hecho de que el oligonucleótido de la invención sea complementario de una secuencia que pertenece a un ADN o ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado. Los oligonucleótidos de la invención pueden permitir así discriminar entre la secuencia del gen salvaje y del gen mutado, lo cual puede presentar un interés particular tanto en el análisis de los genes como en las utilizaciones terapéuticas de los oligonucleótidos de la invención.
Los oligonucleótidos de la invención están constituidos generalmente por bases nucleotídicas naturales (A, T, G, C, U), pero pueden comprender asimismo unos nucleótidos modificados o unos nucleótidos que contienen unos grupos reactivos...
Reivindicaciones:
Reivindicaciones
1. Oligonucleótido bicatenario, caracterizado porque está constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprenden cada una en uno de sus extremos 3' o 5' de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16.
2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque está acoplado a unas sustancias que favorecen o que permiten su penetración, su apuntado o su direccionamiento en las células.
3. Composición, en particular farmacéutica, para ser utilizada con fines terapéuticos o de diagnóstico, caracterizada porque comprende a título de agente activo por lo menos un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Utilización de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para el tratamiento de un cáncer.
5. Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque dicho cáncer es el cáncer de la próstata.
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