OLIGODESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS COMBINADOS CON RAPAMICINA PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER.

El uso de defibrotida en combinación con rapamicina para la fabricación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de tumor dependiente de angiogénesis.

Formulaciones con acción tumoral dependiente de angiogénesis

El objeto de la presente invención es un método para el tratamiento de un mamífero que padece tumor en el que a dicho mamífero se le administra una cantidad eficaz de defibrotida en combinación con rapamicina; en particular se refiere al uso de defibrotida en combinación con rapamicina para el tratamiento de tumores dependientes de angiogénesis.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso multietapa que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasculatura preexistente y es necesaria para el crecimiento tumoral primario, invasividad y desarrollo de metástasis (20). Normalmente está suprimida en el adulto, en el que la angiogénesis se produce transitoriamente solamente durante la reproducción desarrollo y cicatrización de heridas. Adicionalmente, por encima de un volumen crítico, un tumor no puede extenderse en ausencia de neovascularización (12). Para promover esto, un tumor debe adquirir el fenotipo angiogénico que es el resultado del equilibrio neto entre reguladores positivos (pro-angiogénicos) y negativos (anti-angiogénicos) (16). Sin embargo, los tumores son altamente heterogéneos en la arquitectura vascular, diferenciación e irrigación sanguínea funcional (24). Estas diferencias en cuanto al tamaño de tumores preangiogénicos avasculares pueden deberse en parte a la capacidad de las células tumorales para sobrevivir en diferentes grados de hipoxia (18).

La demostración de la dependencia de angiogénesis de determinados tumores, tales como mieloma múltiple, incluso leucemias y linfomas no sólidos (8) y (21), así como cáncer de mama (25), colorrectal (7), gástrico (26), de próstata (9), de cuello uterino (19), hepatocelular (23) y no microcítico pulmonar (13) procede de la observación de que la medición del grado de angiogénesis, la densidad de los microvasos, es un factor de pronóstico independiente para la supervivencia en las entidades clínicas mencionadas (17). En un estudio clínico reciente, de nuevo en carcinoma de mama, resulta evidente que los genes relacionados con la angiogénesis son importantes para resultados clínicos, por ejemplo, el factor de crecimiento celular endotelial vascular VEGF, el receptor FLT1 de VEGF y la metaloproteinasa MMP9 (6).

Definiciones

El término defibrotida identifica un polidesoxirribonucleótido que se obtiene por extracción de tejidos animales y/o vegetales pero que también puede producirse sintéticamente; el polidesoxirribonucleótido se usa normalmente en forma de una sal alcalino metálica, generalmente una sal de sodio, y generalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 45-50 kDa (Número de Registro CAS: 83712-60-1). Preferentemente, la defibrotida presenta las características físicas/químicas descritas en (4) y (5), que se incorporan en este documento por referencia.

Descripción de la invención

Los autores de la invención han desarrollado recientemente un modelo para una ruta alternativa de angiogénesis tumoral. Además del crecimiento de células endoteliales a partir de vasos preexistentes, los autores de la invención sugieren que las células endoteliales en sangre también podrían dar lugar a vasculatura tumoral. Estas células de tipo endotelial (ELC) pueden transdiferenciarse a partir de células dendríticas asociadas a tumores en condiciones de cultivo específicas (11). En resumen, monocitos procedentes de productos de leucoféresis de donantes de sangre humana sanos se filtran por lavado y se cultivan en presencia de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) e interleucina 4 (IL-4) para estimular la diferenciación de células dendríticas (DC). Además, las células se tratan con un cóctel específicamente liberado por células tumorales (M-CSF, IL.6 y lactato, Gottfried et al., manuscrito presentado) para promover el resultado de células dendríticas asociadas a tumores (TuDC).

Estas TuDC-ELC adquieren el fenotipo de células endoteliales (FactorVIII relacionado con Ag, vWF) aunque pierden marcadores monocíticos (CD14) y de células dendríticas (CD1a). Cabe destacar, que no expresan CD34, ni CD133

o CD146 lo que promueve que sean auténticos productos de transdiferenciación y no contaminantes de progenitores endoteliales circulantes (CD34, CD133) o de células endoteliales circulantes maduras (CD146). Además, pueden formar estructuras tubulares en MatrigelTM, en un ensayo de angiogénesis in vitro.

El ensayo en MatrigelTM es uno de los ensayos más conocidos y ampliamente usados en ensayos de angiogénesis in vitro (22).

MatrigelTM es una mezcla sintética semisólida de proteínas de la matriz extracelular que simulan la matriz que existe fisiológicamente por debajo de la pared celular endotelial de un vaso sanguíneo. Cuando las células en cuestión se cultivan sobre esta matriz en portaobjetos de cámara microscópica, se activan para formar estructuras tubulares en 3-7 días, pero solamente en el caso en el que tengan un fenotipo endotelial. Por lo tanto, este ensayo es adecuado para demostrar la posible capacidad de las células para dar lugar a una vasculatura tumoral.

Los datos de los autores de la invención demuestran que la defibrotida en concentraciones clínicas y subclínicas puede inhibir la formación de tubos de la transdiferenciación de ELC (TuDC-ELC) en MatrigelTM. Se incubaron TuDC-ELC y células endoteliales diferenciadas, maduras [células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) o células endoteliales microvasculares humanas (HMEC) como controles “estables”] en presencia o ausencia de Defibrotida (10 µg/ml cada uno) durante 7 días. Cabe destacar, después de una sola adición de Defibrotida, que HUVEC y HMEC no se vieron afectadas en su posible formación de tubos, lo que sugiere que la Defibrotida solamente conduce la transdiferenciación de células endoteliales (Figura 1 A). Sin embargo, cuando se añadió Defibrotida repetidas veces, también pudo bloquear la angiogénesis de células endoteliales maduras completamente diferenciadas (véase a continuación).

Usando un programa informático complementario del NIH (Image J, http://rsb.info.nih.gov/ij/), los autores de la invención pudieron cuantificar estos efectos, se calculó la longitud total de los tubos y el área de la fotografía, después la densidad microvascular (MVD) se proporcionó en longitud total/área [pix-1]. La DF regula negativamente de manera significativa (p=0,02, TTEST) la MVD de TuDC-ELC (Figura 1 B).

Para apoyar estos datos con un ensayo alternativo de angiogénesis el crecimiento de células endoteliales de aorta de rata en MatrigelTM se impidió casi al 100% cuando se aplicó DF diariamente (Figura 2), lo que sugiere que DF no sólo interviene en la transdiferenciación, sino también sobre las células endoteliales maduras completamente diferenciadas.

El ensayo de anillo aórtico investiga células endoteliales macrovasculares. Pero a menudo, la vasculatura tumoral comprende células endoteliales microvasculares. Por lo tanto, se realizó un tercer ensayo de angiogénesis in vitro basándose en la vascularización de células endoteliales microvasculares a través de una capa de fibroblastos dérmicos después de 9-11 días de cultivo. Posteriormente, estas estructuras de tipo vaso pueden visualizarse mediante tinción para CD31 y vWF.

Como se demuestra en la Figura 3 (A y B), la DF también puede bloquear la angiogénesis de células endoteliales microvasculares humanas con una superioridad para la aplicación diaria. Cabe destacar que, las concentraciones de aproximadamente 10 µg/ml parecen ser las más eficaces. Una sola aplicación de DF podría no bloquear significativamente la angiogénesis.

Considerados en su conjunto, los datos de los autores de la invención sugieren firmemente que la defibrotida puede bloquear la angiogénesis de células endoteliales de transdiferenciación asociadas a tumores y de aquellas que provienen de células vasculares ya existentes.

Es objeto de estudios en curso si la defibrotida también inhibe la angiogénesis in vivo. Actualmente los autores de la invención realizan un ensayo de cámara dorsal dérmica (14) que investiga el efecto de la defibrotida en un modelo de ratón con carcinoma gástrico humano altamente vascularizado (sistema de Xenoinjerto). Los primeros datos demuestran claramente que la densidad microvascular (MVD) de tumores tratados con DF es menor que la de los tumores de control. Este conjunto de experimentos se... [Seguir leyendo]

1. El uso de defibrotida en combinación con rapamicina para la fabricación de una formulación farmacéutica para el tratamiento de tumor dependiente de angiogénesis.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha defibrotida se obtiene por extracción de tejidos animales y/o vegetales, preferentemente de órganos de mamíferos.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha defibrotida se obtiene de sintéticamente.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho tumor dependiente de angiogénesis es un mieloma múltiple.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho tumor dependiente de angiogénesis es un carcinoma mamario.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha formulación se administra a un mamífero.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha formulación se administra a un ser humano.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha formulación se administra por vía intravenosa.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha formulación es una solución acuosa.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha formulación contiene excipientes y/o adyuvantes habituales.